间接原位RT-PCR检测石蜡切片中PRRSV核酸方法的建立.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 苗株弱毒疫苗株、猪乙脑病毒提取核酸做PCR。 1．2．2 间接原位RT-PCR检测PRRSV方法的建立 1．2．2．1载片准备清洁的玻璃载玻片和盖玻片浸酸48小时，流动清水洗24小时，蒸馏水冲洗2次，置 这一处理的载玻片在高温反应中不会掉片。盖玻片用2％的DMDC硅化处理，使其表面形成小反应室。 1．2．2．2组织切片制备按常规方法制备组织切片。切片厚59m，制备过程应注意操作时戴手套，70％酒 精擦洗工作面、切片机的刀架、摇柄和载物台等手常接触的部位。展片时用0．04％DEPC处理过的超纯水。 切片放在60℃干烤6．8小时，进行下一步实验。 x HCI，室温，20 1．2．2．3原位RT-PCR反应切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精入水浸泡5min2次：0．2molFL 水洗，无水乙醇；PCR反应液，指甲油封片。反应条件，30个循环；PCR反应完成后，取出玻片用小刀橇开 除指甲油，然后于100％酒精(I)、(II)各2min去除二甲苯。37℃预杂交60min(预杂交液：50％玄离 X x 子甲酰胺、5 SSC、5 X X 交液：50％去离子甲酰胺、5SSC、5 X x x X2 SSC洗5min2次，O．5SSC洗10min 2n∥pl探针)盖上硅化好的盖玻片，37℃湿盒中过夜。杂交经2 次，加上封阻液30 min，用吸水纸接触载玻片边缘吸玄封阻液，每样品中加1009l用109l4099／m1．亲和素 50mmol／L ．碱性磷酸酶结合物与901．tl结合物稀释缓冲液混合液，37℃，30min，在100mmolFLTris·CIpH7．5／1 x NaCI中洗片，室温，15min2，再以碱性磷酸酶底物缓冲液洗片，5min，室温。在BCIP／NBT避光显色， 直至达到所期望的显色程度，然后，将玻片浸于去离子水中终止反应，其间换水数次，核快红衬染5min， 脱水，透明，中性树胶封片。 1．2．2．4间接原位反转录PCR特异性试验 阳性对照用液相I弭PCR检测为阳性的相同组织的切片作阳性对照。 阴性对照RT-PCR检测阳性的组织切片不经RT处理和以对照组猪组织切片作阴性对照 靶核酸去除对照PRRSV阳性组织的切片用RNA酶预处理后杂交作靶核酸去除对照。 非标记探针对照。用末标记的寡核苷酸探针对PRRSV阳性组织的切片进行检测，作为非标记探针对 照。 空白对照用预杂交液代替杂交液作空白对照。 ‘ 2结果 2．1液相RT-PCR扩增结果 引物扩增时，只是特异性地扩出了PRRSV的核酸，见图l略 ， 2．2 间接原位逆转录PCR条件优化 ， 用80I_tg／m1蛋白酶K进行消化，不同的组织消化时间不一样，但本试验所用的材料的结构差别不大，所 以消化时间差不多，一般15—20 行逆转录，42℃，1h。然后PBS漂洗，梯度洒精脱水。按组织块大小加上适量的PCR反应液，覆盖组织表 面，并盖上硅化好的盖片，以质量较好的透明指甲油密封盖玻片四周，指甲油干后，再以矿物油覆盖盖玻 片四周，防止PCR反应液在PCR循环过程中蒸发；PCR反应完毕后，取出切片，用小刀撬开盖玻片，4％多 一碱性磷酸酶结合物)溶液，平放切片于加热湿盒中，室温下温育30min。加入酶结合物后，不能使组织 样品干涸。反应结束后，将切片于100mmol／LTris·CI 267 猪传染病 甲苯中透明，树脂胶封