罗汉果ISSR-PCR反应体系的建立.pdfVIP

第22卷第3期 广西师范大学学报(自然科学版) V01．22 No．3 2004年9月 GUANGXINORMAL JOURNAl，OF UNIVERSITY September2004 罗汉果ISSR—PCR反应体系的建立 周俊亚，宾晓芸，彭云滔，唐绍清 (广西师范大学生命科学学院，广西桂韩541004) 摘要：以罗汉果(Siraitia DNA 聚合酶的用量以及循环次数对ISSRPCR扩增结果的影响，确立了稳定的、可重复的罗汉果ISSR最佳反应 体系和PCR扩增参数：在25 pL的PCR反应体系中，含20～50“g模板DNA，1UTaq酶，1×PCR缓冲液， 2．0 2，4种dNTPs各2005 mmol／I，MgCI pmol／I，，0pmol／I。引物；PCR扩增程序为94。C预变性3min，接着 进行40个循环：94。c变性1min，52。C退火50s，72。c延伸2min．循环结束后72。C延伸7min． 关键词：生物化学}罗汉果；ISSR；反应体系；遗传多样性 中圈分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1001—6600(2004)03—008l—04 简单序列重复区间(inter—simplesequence 年创建的，是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术．ISSR技术利用在植物基因组中常出现的SSR本 身设计引物，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增．由于SSR在真 核生物中分布非常普遍，且串联重复的数目是可变的呈现高度多态性“j，因而ISSR—PCR可以检测基因组 中丰富的遗传变异．目前ISSR技术己用于植物品种鉴定n“。、遗传作图Is,6]、遗传多样性”“1和居群遗传 学：io]等研究中． Je{frerexAMLuelZY 罗汉果(Siraitiagrosvenorli(Swing／e)C Zhang)是单性、雌雄异株的葫芦 极高的甜味物质是一种低热量的理想天然甜味剂[1“，是肥胖症、糖尿病患者理想的糖替代晶．它的果实还 是传统中药，用于治疗支气管炎、急慢性咽喉炎、哮喘和感冒等““． DNA聚合酶的用量以及循环次数等都会影响 序的影响o]，如模板DNA，Mg”，dNTPs，引物的浓度，Taq ISSR的稳定性和重复性．本文以罗汉果为研究材料，对各因素的最佳反应条件进行筛选，获得了背景清 晰、可重复的扩增条带图谱，建立了适合罗汉果的ISSR反应体系，目的在于利用ISSR标记技术研究罗汉 果的遗传多样性，为罗汉果种质资源的保护和利用提供科学的依据． 1材料与方法 1．1材料 实验材料罗汉果(Siraitia 提取罗汉果叶的总DNA． 1．2 PeR反应与产物检测 PCR扩增反应在UNOⅡ48型扩增仪上进行．初始反应条件：在25pL反应体系中，50“g模板DNA， IU t』mol／L引物；扩增程 Taq酶，1×PCR缓冲液，2．0rnmo[／I，MgCl7，4种dNTPs各200,umol／L，0．5 min，接着进行40个循环：94。c变性1min，52。C退火50s，72。C延伸2min，循 序：模板94。c预变性3 收稿日期：2004—04—02 基金项目：国家自然科学基金资助项目 965～)，男．广西恭城人，广西师范大 作者简介：周俊亚(1979一)，女，广西桂林人，广西师范大学硕