双重荧光定量RT-PCR方法鉴别甲型和乙型流感病毒.pdfVIP

第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 双重荧光定量RT—PCR方法鉴别甲型和乙型流感病毒 何永强1 张严峻2张弘3帅江冰1高晓嵩1李禾1吴姗1朱振江1戴云通1 (1．浙江出入境检验检疫局 杭州310016；2．浙江省疾病预防控制中心；3．浙江中医药大学附属第一医院杭州310006) 摘要：为了能快速分析掌握流行性感冒病毒的型别及其流行情况，分别选取甲型流感病毒M基因128bp和乙型流感病 毒NP基因1 效的鉴别甲型、乙型流感病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法，并评价其重复性、特异性和灵敏度。结果显示质粒标准曲线 本检测，结果为甲型流感病毒核酸阳性52份，乙型流感病毒核酸阳性19份。表明本文所建立的双重荧光定量RT—PCR方法快 速、特异、灵敏，为临床一次性鉴别诊断甲型和乙型流感病毒提供了一种快速、可靠的检测手段。 关键词：双重荧光定量RT-PCR鉴别 甲型流感病毒 乙型流感病毒 流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，其潜伏期短，流行面广，传播迅速。 特别是2009年4月底以来，新甲型H1N1流感病毒在墨西哥发生并迅速在世界范围内流行“’，引起各国政 府的高度关注。由于流感病毒有甲、乙、丙型之分，不同病毒型别或不同毒株感染在临床症状上类似(2-3)， 给防控工作带来很大困难。监测是确定流行株、发现变异株、预测疫情和防控的基础‘4刊，所以，在甲型H1N1 流感病毒广泛流行的情势下，是否存在乙型流感或季节性流感病毒的流行同样值得关注。因此，为了能准 确、快速地分析掌握流行性感冒的流行概况，筛查可疑流感病例，明确优势毒株，本文采用多通道和多探 量RT—PCR检测方法。 1材料和方法 1．1试剂和仪器 1．1．1酶与试剂：酶与试剂：M—MLV反转录酶、dNTP、RNasin、pGEM—TEasy载体试剂盒和RiboMAXLarge ScaleRNAProduction 公司；甲型通用型RNA检测试剂盒(荧光PCR法)购自上海科华生物工程股份有限公司。 1．1．2仪器：Rotor gene 1．2临床样本采集和预处理采集流感样患者(发热，3d内，体温在38。C以上，伴有头痛、咳嗽、喉痛、 0．01mol／L)中，充分振荡，经8000r／min，离心10min，取上清液检测。 1．3双重荧光定量RT-PCR检测方法建立 将RNA沉淀溶于20ul无RNA酶的灭菌水中，作为RT—PCR模板备用。 1．3．2阳性标准品的制备分别将甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NP基因进行RT—PCR扩增，然后与 pGEM—T ScaleRNAProduction Large System—T7进行体外转录，产物经过酚：氯仿纯化，紫外分析仪测定浓度后 分装备用，作为转录标准品，分装备用。 1．3．3引物和探针的设计利用GenBank的信息，根据甲型流感病毒和乙型流感病毒基因文库，分别选择 基金项目：浙江出入境检验检疫局重点科技项目；浙江省医药卫生科技计划项目(2012KYAl42) 作者简介：何永强，男，研究员，主要从事动物疫病检疫和分子生物技术研究，Tel．：0571—81 100350，E-mail：hyq@ziq．gov．ca ·——476—— 辐·$ ，j 3物日州引』I；刊c0-3’j㈨F TCTAACCGAGG3CGAAACGI一■： }：I型流毒痫，H：l。游引物f11：51 F游tjI物R1： 3‘ ≯“^Ⅲ(Ⅷ；I^(，Ⅲ(㈧^(一j_探针I，l：∥一lIEX—CCTCAAAGC∞AGATCGC—BHQl ￡型_L一毒柏f0：I‘游引物1：2：5‘TGTTGGTT、GGTGGGAAAG一0。：F游一