实验五醋酸纤维素膜电泳.pptVIP

实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、基本原理 （一）电泳的定义 带电颗粒在电场的作用下向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 （二）基本原理 带电粒子在电场中运动，是物质的一种运动现象。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。 生物大分子在电场中移动的速度决定于它的分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目，还与分离介质的阻力、溶液粘度及电场强度等因素有关。 蛋白质是两性电解质，其在等电点时呈电中性状态，在电场中既不向负极移动，也不向正极移动。 血清中各种蛋白质的等电点多低于pH7.4，因此在pH比其等电点高的缓冲液(pH8.6)中，它们都解离成负离子，在电场中向正极移动。因为各种血清蛋白等电点不同(故而在同样pH值下带电荷数不同)以及分子量不同，因而在电场中的移动速度不同。 蛋白质分子小而带电荷多者，移动速度较快；分子大而带电荷少者泳动速度较慢。 据此原理可利用醋酸纤维薄膜电泳将血清蛋白分为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白等5条区带。 二、基本操作 （一）电泳准备 1.将醋酸纤维薄膜切成2cm宽、8cm长的小条。 2.浸泡：将薄膜有光泽面向下漂浮于缓冲液中，浸泡5～10min，待膜完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液。 3.点样：在无光泽面距一端约1cm处，用点样器(或较细而尖端光滑的微量吸管)取血清约2～3μl，进行点样。 4.上槽：待血清吸入膜后，以无光泽面向下、两端紧贴在滤纸桥上(加血清的一端贴在电泳槽阴极端，切勿使点样处与电泳槽接触)，加盖，平衡2～3min，然后通电。 （二）电泳 电压约100～160V，时间30～60min （三）染色及漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于氨基黑染色液中2～3min。然后取出用漂洗液浸洗脱色，至背景完全无色为止。 三、注意事项 1．电泳图谱不齐：点样时血清滴加不均； 2．电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或由于电泳槽密闭性不良，或电流过大造成水分蒸发，薄膜干燥； 3．分离不良：标本滴加过多； 4．区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05； 5．区带过于紧密：缓冲液离子强度大于0.075； * * *