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SUPERSWITCH? RACE cDNA Amplification Kit使用手册 目录 I.简介 1 II. SUPERSWITCH? cDNA 合成技术 1 III.简述 2 IV. SUPERSWITCH?试剂盒组分 3 V.注意事项 4 VI.引物设计 4 VII.总RNA和Poly A+ RNA制备与处理 6 VIII.第一链cDNA合成 6 IX.快速扩增cDNA末端 7 X. RACE产物鉴定 8 XI.常见问题的解决方案 9 XII.参考文献 13 简介 SUPERSWITCH?PCR cDNA合成试剂盒通过扩增基因的5和3末端精细有效地完整克隆基因。SUPERSWITCH? RACE方法可有效地在cDNA 5 和3 末端加入人工接头，尽可能地最完整的RACE产物。5和3 RACE PCR反应，无需再进行繁复的第二链cDNA合成和接头连接的过程。其他RACE方法均高背景和截短的5 末端而存在显的劣势。优化的方法既便是在样本很小的情况下也可以显著降低非特异性的扩增只需单一PCR管和两步法的程序就可使您的RNA样品合成cDNA。此外，SUPERSWITCH?技术由于避免了接头连接的步骤，使您在RACE PCR过程中直接使用cDNA作为模板，从而降低了RACE的过程的复杂性，并使其更快捷Chenchik et al，1998），操作时间更缩短至4个小时。 SUPERSWITCH? PCR RACE Kit也对PCR过程加以优化，同时增加了RACE反应的灵敏性并降低了背景。因此，您可以用很少的或是总RNA作为模板构建全长cDNA。SUPERSWITCH? cDNA 合成技术 常cDNA合成方法均逆转录酶（反转录）将mRNA转录成第一链单链cDNA（single-stranded DNA，ss DNA）。受限于反转录的效率，基因的5端在反转录过程中常常不能被转录，最终形成的cDNA的5端通常并不完整。续出现二级结构oligo（dT）引物5端cDNA链合成截短的现象尤为突出。未降解RNA构建的cDNA文库中出现截短的cDNA的分子常因反转录过程异常终止所。，SUPERSWITCH ?方法能够优先富集的全长cDNA片段。 SUPERSWITCH?可将多聚腺苷酸mRNA或总RNA反转录合成cDNA。而反转录合成所使用的引物均是经过（3 SUPERSWITCH? 3RRT1/ 3RRT2 ）（图1） 。当反转录进行至基因mRNA的5 末端时，SUPERSWITCH?的末端转移酶的活性可在cDNA的3末端增加以胞嘧啶C为主的其他核苷酸。由于SUPERSWITCH? 5RRT引物在其3末端富含胸腺嘧啶G，这样通过C-G之间的碱基配对，反转录的cDNA又以5RRT为模板进行延伸，直至5RRT引物的末端（Chenchik et al1998）。最终产生的完整的单链cDNA包括完整的5端基因，以及与SUPERSWITCH?引物互补的序列。SUPERSWITCH?和SUPERSWITCH?的引物扩增形成了cDNA的5末端至3末端的扩增。反转录过程mRNA模板5末端中止前，全长cDNA-RNA间碱基配对效率要远远高于SUPERSWITCH?与RNA的配对。因逆转录活性不完全成的序列不完整cDNA或是基因组DNA污染将以非指数型进行扩增。初始转录本中降解的RNASUPERSWITCH?试剂盒内SUPERSWITCH?和SUPERSWITCH?扩增最终的。 图1. SUPERSWITCH? 技术的流程oligo（dT）引物起始。反转录到达mRNA模板末端时，反转录酶所具有的末端转移酶活性会在cDNA3端加入dC残基。而SUPERSWITCH? 5RRT引物与cDNA3端加入dC残基间的退火将为SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase的反转录过程提供一个可供延伸的模板。 简述 引物设计（详见第Ⅵ节A） 无论是5-RACE和（或）3-RACE反应都必须要设计基因特异性引物（gene-specific primers，GSP），分别命名为GSP1和GSP2。其各自的巢式PCR基因特异性引物(NGSP1和NGSP2)可用于RACE产物的分析。在某些情况下，这些巢式的引物也可用于RACE PCR反应。第Ⅵ节中会详述引物设计的方法。图2显示了SUPERSWITCH? RACE反应中所使用的引物与其序列来源的相对关系。 图2. 基因特异性引物与cDNA的关系 该图显示第一链cDNA模板，在制备好的5RACE或3RACE用的cDNAs中RNA和DNA杂交链不一定出现。 第一链cDNA合成（详见第Ⅷ节） SUPERSWITCH? RACE Kit可以合成两种类型的cDNA——5-RACE用的cDNA和3-RACE用的cDNA，