SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定.docVIP

SOD、POD、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸、电导率、可溶性糖的测定 一、磷酸缓冲液的配制： A液：0.2M的KH2PO4溶液 称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。 B液：0.2M的K2HPO4溶液 称取分析纯K2HPO4?3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。 或 （A液：0.2M的NaH2PO4溶液 称取分析纯NaH2PO4?2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液 称取分析纯Na2HPO4?12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。） 酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升 0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。 SOD的测定： 1.SOD反应液的配制： 母液的配制： 05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml; (2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；棕色瓶避光4℃保存。 （3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；棕色瓶避光4℃保存。 (4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，棕色瓶避光保存； (5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。随用随配。棕色瓶避光保存； SOD反应混液： 磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为15：3：3：3：2.5，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素和酶液。 2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30分钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以空白调零，560nm比色。每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照） 3.结果计算 SOD总活性（吸光度/g·FW）=（ACK—AE）×V／（W×0.5 ×Vt×ACK） 单位：NBT光还原50%为单位 SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。 POD反应液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。 POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，以PBS为对照调零nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值（ΔA470/min·mg pr或ΔA470/ mgFW）表示酶活力的大小。 结果计算：POD活性POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）aOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100毫升。 MDA的测定：1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后1500转10min离心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。 2.结果计算：MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA含量(umol/g FW)=C×V/W V为提取液体积(ml)，W为样品鲜重(g) 六、可溶性蛋白的测定 反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。 100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液 10mg BSA,0.9％氯化钠溶解，定容至100ml80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液为对照调零 七、脯氨酸含量的测定 试剂配制： 0.3%磺基水杨酸：3克磺基水杨酸，定容至100毫升： 2.5%酸性茚三酮（现配）：60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加