高效毛细管电泳分析红枣中cAMP与cGMP的含量.pdfVIP

高效毛细管电泳分析红枣中cAMP和cGMP的含量 张雅利1，刘长江2 (1西安交通大学生命科学与技术学院陕西西安710049．yarlee@16—3—．com, 2西安交通大学体育部陕西西安710049) cm 摘要目的：建立高效毛细管电泳法测定红枣中cAMP和cGMP含量。方法：用未涂层熔融毛细管柱50 ×50pm，有效分离长度40cm20mmol／L磷酸盐缓冲液(K出P0。一l(HzP0。)，pH9．8为介质：操作电压19KV, 细管电泳法可用于测定红枣中cAMP和cGMP含量 环腺苷酸(CyclicAdenosine一3’，5’monophate，简称cAMP)和环鸟苷酸(CyclicGuanosinc．3’，5’．monophatc， 简称cGMP)合称为环核苷酸，为当今分子生物学研究的重要内容之一。cAMP为蛋白激酶致活剂，是细胞 内传递激素和递质作用的中介因子，作为第二信使参与多种生理生化过程的调节，能舒张平滑肌、扩张血 管、改善肝功能，对心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癣等疾病有显著疗效。cGMP是cAMP的拈抗 物，它们一起调节细胞的生长、发育等重要过程，并在分子免疫反应、恶性疾病的转变过程中起着重要作 用…。 红枣中含有50多种化学物质，包括有多糖、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素A、Bl、B2、C、E、 P，有机酸和包括硒在内36种微量元素，美味可口，营养丰富。常用于中药，具有补血、健脑、抗癌及健 脾强身等功效，《神农本草经》中列为上品，历代本草中均有收载[21。KHanabusa等报道了大枣中cAMP 的含量在高等植物中是最高的，是鳄梨含量10倍以上口J。目前，国内对大枣中cAMP的研究仅限于高效液 相色谱法、竞争蛋白法等，未见高效毛细管电泳法测大枣中cAMP和cGMP含量研究的相关报道。本文旨 在建立一种灵敏度高、快速、简单的红枣环核苷酸测定方法。 1．材料和方法 crux50 I．I仪器：Bio—focus(TM)3000型毛细管电泳系统，美国Bio—Rad公司；未涂层熔融毛细管柱：50 Inn，有效分离长度40cm，购于河北永年光纤长；KQ一250型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。 附树脂，购于天津南开大学化工厂；对氨基苯甲酸(p-ABA)，购于上海试剂三厂；其他试剂均为分析纯； 水为重蒸水；红枣选择陕北木枣，市购。 2．结果 2．1电泳条件的确定：电压：正相工作电压19KV：柱温：20C；检测波长：254nm；电泳缓冲液：20mmol 2min。 2．2溶液制备 量cGMP．Na用重蒸水配成5．09·L4的溶液，依次倍比稀释得系列浓度的对照品溶液备用。 2．2．2样品溶液制备：陕北木枣经挑选、洗涤、60。C烘烤2小时，破碎，取6份，每份109，加10倍水， 取上清液40mL，加于预先处理好的大孔吸附树脂柱(2．Ocm×20cm)上，先以100mL水洗脱(控制流速， 使低于0．5mL·min。)，弃去洗脱液，再以30％乙醇200mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加内标溶液 lmL，以水溶解，定量转移至5mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，上清液过0．45um微孔溏膜备用【4J。 2．3样品超声破碎时间：超声处理天然植物能快捷、简便、有效的提高功能成分提出率，且不改变化学 示，环腺苷酸含量随超声处理时间的延长而有所增加，但超声处理时间超过40min，其含量未见升高。 2．4标准曲线的制作：选取不同浓度标准品溶液在上述电泳条件下分别进样6s，记录各自峰面积，以标 准品含量为横坐标，标准品峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，进行回归分析，得cAMP和cGMP回归 2—600rag·L～；在信噪比为3的情况下检测下限分别为7．0×10击g·InL。1和0．9X 10‘69·mL一。 112 2．5精密度试验：分别取浓度为60ug·mL-1的cAMP和cGMP标准溶液，加入内标溶液，按上述电泳条 件连续进样5次，测峰面积和迁移时间。结果