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植物基因克隆技术及其发展方向 摘要：基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象，开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理，对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入，近年来其研究方法不断改进，新技术不断涌现，这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。 关键词：植物基因 克隆基因 植物基因转化 正文: 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容,它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的,其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列,确定其在染色体上的位置,阐明其生化功能,并利用生物工程手段应用到生产实践中 一、 1、 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 　　 2、通过遗传表型分析 　　 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编码的激发子与寄主抗病基因编码的受体之间存在不亲和的互作关系，以病原激发子蛋白为线索分离和克隆出一些几丁质抗病基因，如番茄与无毒基因avr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 　　 3、以图谱为基础的定位克隆技术 　　 二、发展中的基因克隆新技术 　　 1、 （1）核DNA消减法。该法主要是利用许多缺失突变体与其未缺失的同源亲本只有1-2个DNA片段的差异，通过将大量特殊标记的突变体DNA与少量未缺失亲本DNA相混合，变性后在适当温度下复性，待反应体系中的单链DNA重新配对成双链后，除去标记的突变体DNA和与之杂交配对的亲本DNA。如此几轮选择后，反应体系中最后只剩下在突变体核DNA中所缺失的那一段亲本DNA，最后对亲本特异DNA片段进行克隆。 　　 (2)核DNA消减--PCR法。该法是核DNA消减法的发展，它将经特定限制性内切酶处理的未缺失亲本DNA（备测DNA）与大量经超声波切割、光敏生物素标记的突变体DNA(减法探针DNA)混合，经变性复性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球悬浮液除去各种杂合体，富集的亲本特异性DNA再经几轮筛选后加接头序列和T4DNA连接酶，然后加入单链接头序列作PCR引物进行PCR扩增，最后PCR产物直接克隆或32P标记后作探针与亲本DNA或核DNA文库杂交，确定出这些DNA片段所编码的基因，应用上述方法已分离出拟南芥菜与赤霉素合成有关的基因gal以及冰草的盐胁迫诱导基因等。 　　 2、 真核生物基因组DNA中只有很小一部分编码mRNA，而大部分则为内含子、外显子和重复序列，目前通过大规模基因组测序来寻找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分离表达序列的方法中，cDNA捕捉法是较成功的一种方法，已用于许多基因的定位克隆。 　　 （l）cDNA文库差示筛选法，这是一种直接分离组织或发育特异表达基因的方法，例如对于两种不同的组织细胞，先提取它们的poly(A)+mRNA，分别构建这两种组织的cDNA文库，然后以这些mRNA为模板，合成放射性标记的cDNA探针，再用这两种探针分别与一类cDNA文库的两套重复考贝杂交，跟两种探针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基因，而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的mRNA，再对这样的克隆进行测序比较和鉴定，就可分离到这种组织特异表达的基因。用这种方法已分离到许多根茎叶和生殖器官等特异表达的基因。 　　 (2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一种以表达为基础的基因分离技术。它直接用基因组DNA如酵母人工染色体(YACs)捕捉cDNA片段，从而达到快速地从大的基因组区域分离表达序列。其主要技术是用PCR扩增来自不同组织的混合cDNA池或已克隆的cDNA文库，扩增的cDNA片段与用生物素随机标记的基因组目标DNA杂交，捕获亲和素标记磁珠上的与目标DNA杂交的cDNA片段，然后洗脱磁钵上捕获的cDNA并进行PCR扩增，再