实验7——茚三酮法测定氨基酸总量.ppt

实验七：茚三酮法测定氨基酸总量 1．实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。 2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。 试剂配制：讲义P32 （1）2%茚三酮溶液 （2）pH8.04的磷酸缓冲液 （3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮氨酸标准溶液。 （2）标准曲线的绘制及样品测定 4.结果计算 5. 注意事项 （1）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。 （2）有颜色的样品必需经脱色处理至无色后方可使用。 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤： 3. 实验步骤 （1）样品的处理：量取0.5mL酱油于50mL烧杯中，加入5g活性炭和40mL的蒸馏水，在电炉上加热至80℃左右，保持半小时后过滤至100mL容量瓶中，用蒸馏水将滤渣清洗数遍后转移容量瓶中，定容至刻度线备用。 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 茚三酮 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 磷酸盐缓冲液 0.6样品 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0 氨基酸标准溶液 1.0 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.6 水 7、8、9 6 5 4 3 2 1 各种试剂加到比色管后混匀，于水浴锅上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以氨基酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 单位：mL 氨基酸（μg/mL）= C×K V × 100 式中： C——从标准曲线上查得的氨基酸含量，μg K——稀释倍数 V——测定时取样量，mL