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第三章 酶的提取与分离纯化 电泳（electrophoresis, EP） ：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。 一、电泳的基本理论 1. 原理: 在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 2. 电泳的分类 自由界面电泳：又称移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。 凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。 Acr与Bis的重量比应在30左右。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。 第五节 纯化方案的设计与评价 一、纯化方案的设计 1 纯化方法的选择依据 根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 ▼调节溶解度：沉淀法 ▼根据分子大小、形状的不同： 离心分离，膜分离，凝胶过滤 ▼根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳 ▼根据专一性结合的方法：亲和层析 ▼其它：吸附层析，疏水层析 ★ 2 纯化方法的排序 先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。 ★ 二、纯化方案的评价 1 酶活力测定： 酶活力(enzyme activity)又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量. 是酶催化某一化学反应的能力。 ★ 方法： 在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。 ★ 常用的方法 ： ▼化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液 。 ▼分光光度法:利用底物和产物光吸收性质的不同 。 ▼量气法:酶促反应中产物或底物之一为气体。 ▼滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。多用pH电极测。 ★ 常用终止反应方法： ▼改变反应最适条件： 加酸、碱、加热 ▼加酶变性剂： 5％三氯乙酸 ★ 酶活力单位：通常采用国际酶学委员会规定的单位。 在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。 ★ 2 蛋白质浓度测定 ▼紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。 ▼双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速.缺点：灵敏度差 ▼酚试剂（Folin-酚）测定法： 繁琐，但灵敏度、准确度高。 ▼染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是常用的检测法。 ★ 3 酶的纯化指标 纯度 提纯倍数 回收率 常用比活力表示