氨基酸序列突变对TFPI生物半衰期与生物活性的影响.pdfVIP

氨基酸序列突变对TFPI生物半衰期和生物活性的影响’ 余波1 罗师平1 宋丽萍1冷希岗1赵明辉2牛惠生2 1．中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程研究所， 天津生物材料重点实验室，天津，300192} 2．中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所，天津，300192 关键谓 生物药物学TFPl突变血浆清除 一、麽l昌 factor 缱织融子途径抑制因子(ti鼹ue path珊y 糖基化位点．蛋白结构依次包括酸性的氨基竭。三令库尼型续构域及碱性的羧基端．其中第二个库琵 基端及第三个库尼塑结构域为肝索及血管肉皮细胞的结合位点[1_3】． 虚，从而使纛浆TFPl水平提高数倍．Dahm 栓形成．Hemhough 管内皮纲胞增生，在体内具有抗肿瘤强控．Christoph 廉从搿抑制血管再狡窄．上述研究证明TFPl具有较高的药用价值． 通过其禽有酸性和碱性氨基酸残基的Ⅱ和Ⅳ配体结合位点．与配体发生电荷依赖性受体一配体静电吸 性氨蒜酸残基发生静电吸引作用将其结合并内吞人细胞。TFPlK3结构域和C端富禽带正电碡的碱 ☆力．为Ill：我们提出通遂不同稷瘦地减弱TFPI 变的前提下延长其生物半寰期的基率设想． -一．L—L-h～●‘一．_L、-．■‘ 一、阳科审力壤 (一)材特 限制憔内切酶，T4 *率研究受夭潞市应用基确研究重点项目赍助(0338016l” ·33· Flow、He阳rinSepllarose B+otech和T080}ICorpo趣一 CL一6B和Seph8dexG一75分别购自Ph^rmacia DNA tionI Marker及蛋白Marker购鑫北京鼎国；F舵tor DNA测序委托上海生物工程研究所． (二)方法 1．表达TFPI重组蛋白羧基端突变体的置缎酵母菌的构建 (1)突变体表达质粒的构建构建三个含有TFPlC壤突变的表达载体．用大引物PCR定点诱变 ggc ctaatt ctaatta瓶acc gat鹋cg曩t鼬e腿aaga聃g聃g髓gaga3’IMlI5’g鼬骶c gcggcggcc gcc邸g gcgcagaga 3’lMI cta矗ttaaaacc ata gtg蛆B鑫垤gc 15’ggaggc agctcgagctc譬agctcgcagagagtg囊aa att gct313’Aoxl5’gact鼯ttcc阳ttga∞agc3’15’Aoxl5’g嗵aatggc ctg矗龃tcc3’．第一轮PCR扩 酶切图谱分析筛选重组体并进行DNA澜序最后确定． pPic9作为空白对照． 挑取转化子接种子lOmL 主细胞的基因DNA中． 2．重组蛋白分析 mL (1)蛋白诱导表达接种经pCR验证的黪母转化子于10 时．敢此菌液按lt 渚进行进一步实验． 用T袋讽(o．5％BSA／loONIaCl／50mmoI／LT“s—HCl mmol／L pH7．8)配成2 2哪l／L mmol／LS一2222， 述稚释的培养