成人骨髓间充质干细胞的分离与鉴定.pdfVIP

成人骨髓间充质干细胞的分离和鉴定 杜振宗1任华2宋剑非1梁岳培1李安桂1郑民1 1桂林医学院附属医院胸心外科广西桂林541001 2北京协和医院胸心外科北京100730 【摘要】 目的本实验拟通过体外细胞培养将间充质干细胞自骨髓血中分离出来，并加以纯化、 鉴定，进一步在体外的培养条件下研究其增殖及生长的特性，从而探讨为组织工程化血管研究提供种 子细胞的可能性。方法收集成人骨髓血，采用密度梯度离心和贴壁生长的方式，提取单个核细胞进 CDl4、KDR、 CDl05、HLADR)；采用细胞计数的方法，绘制原代培养和传代培养细胞的生长曲线。 结果通过密度梯度离心和贴壁生长的方法，可以获取具有一定形态特点、贴壁生长、增殖活跃的骨 原代培养曲线显示，第2～6d为生长潜伏期，第7～8d开始，贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克 隆，第8～10d进入对数增长期；第12～14d进入个平台期：传代培养的细胞多于P。o后开始出现衰老 的现象，传代培养的潜伏期为24～48h，传代培养的对数增长期为4～6d，接种后8～9d，细胞的增殖、 生长逐渐缓慢，进入平台期。结论 1．利用密度梯度离心和贴壁的方法可以获取较高纯度的 CDl05、KDR，不表达HLA．DR、CD34、CD45、CDlla、CDl4。 【关键词】 骨髓，间充质干细胞，原代培养，传代培养，生长曲线 骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，但与造血干细胞相比，骨髓中的间充质干细胞含量并不丰 富。本实验拟通过体外细胞培养的方法，将间充质干细胞白骨髓血中分离出来，并加以纯化、鉴定， 进一步在体外的培养条件下研究其增殖及生长的特性，从而探讨为组织工程化血管的研究提供种子细 胞的可能性。 材料和方法 1．材料 1．1标本来源 骨髓血来源于成人肋骨骨髓，标本是外科手术中正常切除的肋骨，排除血液系统疾病、骨转移性 肿瘤，在手术切除后2h内提取单个核细胞。 1．2主要试剂 bovine (1)DMEM．LG培养基(中国医学科学院基础医学细胞中心)；(2)胎牛血清(fetalserum／FBS) 通讯作者：杜振宗，广西桂林桂林医学院附属医院胸心外科541001 tom duzhenzong@sina 185 医学科学院基础医学细胞中心)；(7)PBS(北京中山生物技术有限公司)。 1．3主要仪器和设备 FACSCIibur，美国)：(9)计算机及图像采集分析系统(Motic—images (Bio-RAD500，日本)。 2．检测方法 2．1流式细胞仪分析 中，置于冰上待流式细胞仪检测；(3)间接标记细胞：待标细胞PBS洗涤3次，滴加KDR抗体，4。C 中，置于冰上待流式细胞仪检测；(4)应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。 2．2细胞形态的观察 不同时间在普通倒置显微镜和相差倒置显微镜下观察细胞形态的变化，并和电脑连接，用数码相 机摄象记录。 3．实验步骤 3．1BMMSCs分离 (1)无菌条件下，挤出骨髓5mL，然后用含肝素0．1％oPBS50mL稀释，充分混匀，转入离心管， 髓稀释液轻轻叠加到20mL 胞。 3．2BMMSCs的培养、扩增和鉴定 (1)收集到的单个核细胞加入细胞培养液(含双抗和15％胎牛血清的DMEM．LG)，记数细胞， 3d后半量更换培养液，弃去未贴壁细胞，2～3d换液1次，细胞铺满瓶底后用胰蛋白酶消化液消化3～ 5rain，1：4 CDl4、KDR、CDl05、HLADR)。 3．3绘制原代和传代培养细胞的生长曲线 培养液，于37。C、5％C02条件下培养，于接种的第3d进行第1次换液，仅更换一半，以后隔日全部 换液，在倒置显微镜下逐日观察细胞形态和生长情况，并适时照相。每天抽取3个培养孔用胰酶将贴 1R6 壁细胞消化分离，计算其均值，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部，进行细胞生长动力学分析，作 为原代细胞培养的