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动物RNA病毒全长感染性克隆的研究进展 曾秀王孝友 范守成 (重庆市畜牧科学研究院 重庆 荣昌402460) RNA病毒的感染性克隆(infectiousclones)是指在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷 贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA转染培养细胞或宿主后具有感染性。这一过程 的实现称为病毒的拯救(rescue)。(1)全长基因组感染性克隆构建技术也叫反向遗传学技术。经典遗传 学通过分析生物性状、表型和遗传物质研究生命的发生与发展规律；反向遗传学则是在获得生物体基 因组全部序列的基础上，再按组成顺序构建含生物体必需的基因元件的基因组，让其装配出具有生命 活动的个体，最后对靶基因进行定点突变、基因插入或缺失、基因置换等必要的改造，构建为修饰基 因组，研究生物体基因组的功能，以及这些修饰对生物体的表型、性状等产生的影响等。 1 研究动物RNA病毒感染性cDNA克隆的意义 (IBV)等，可引起人或动物产生严重的传染病。这些传染病的流行和暴发，给畜牧业和人类健康造 成了巨大损失和严重影响，为此，目前对动物RNA病毒分子生物学特性方面的研究已成为大家共同 关注的焦点。 由于RNA本身的结构特点和不稳定性，相对于DNA病毒来说，更增加了其分子结构及功能研 究的难度。随着反向遗传学的发展，在RT--PCR和体外转录RNA技术基础上建立起来的全长感染 病毒基因组RNA难以操作的难题，可以通过对其cDNA这一稳定基因产物的人为操作，进一步在分 子水平上研究RNA病毒。该技术已成为研究动物RNA病毒的重要方法。 2动物RNA病毒感染性cDNA克隆的内容 构建RNA病毒感染性cDNA克隆的基本内容包括：①获得动物病毒基因组全长cDNA：通过 RT—PcR分段克隆病毒基因组，选择具有重叠部分且覆盖整个基因组序列的数种重组子拼接成全长 cDNA。②对该cDNA进行一定的基因人工操作：可对稳定的cDNA进行定点突变、基因插入或缺 失、基因置换等必要的改造。③利用体外转录等方法将其转变为RNA，用改造后的病毒RNA转染 适宜的宿主细胞，以进行病毒分子生物学研究：选择合适的反向遗传系统拯救出活病毒，可直接转染 培养细胞或宿主，鉴定其感染性。 3动物RNA病毒感染性cDNA克隆的研究进展 ·172· 二、专业论述 噬菌体T7 RNA聚合酶、T7启动子和DNA片段，克隆出具有自我转录功能的DNA模板，并于体外转 录出具有一定长度的小RNA序列。尽管当时只能得到12～35个核苷酸的小片段RNA，但证明了合 V)全长基因组转录产物，并且证明转录产物和用于合成eDNA的RNA一样，具有仙台病毒的株系特 异表型。仙台病毒全长感染性eDNA的构建和应用，标志着动物RNA病毒全长感染性eDNA的首次 研究成功。 和双链、甚至分节段的RNA病毒都相继获得基因组全长感染性cDNA克隆。其中动物病毒中黄病毒 科和小RNA病毒科占了很大一部分。 础，构建了其分子克隆。这些eDNA片段是除了5’末端核苷酸以外的VEEV基因组序列。利用体 外突变技术，将T7启动子、单一G残基和精确的5’末端克隆到5’端大部分片段上游，再和eDNA 扩增中分离的特有限制性片段连在一起，构建出了待用的全长VEEVeDNA克隆。体外合成的RNA 缺少了102个核苷酸，这种缺失体在子代病毒中依然存在，但并不影响它们在CEF和BHK细胞或者 Vero细胞中的生长。 同年，Duechler等利用人鼻病毒2型血清型RNA、T7 RNA聚合酶启动子和覆盖全长基因组的 eDNA拷贝构建了全长eDNA克隆。合成的RNA5’末端包含了2个额外的G残基，转染Hela细胞 形成蚀斑；相反，当合成的RNA在5’端含有16个额外核苷酸时却没有感染性。 菌体SP6启动子后，体外合成的RNA转染BHK一21细胞可产生感染性病毒颗粒，这些病毒颗粒对 原代牛肾细胞及小鼠具有高的感染性。含足够长poly(C)片段的病毒复制子首先在酵母细胞中建 立，这些构建体中的一部分能保留在大肠埃希氏菌中用来产生感染性RNA。cDNA重组质粒中的po— yer等在此基础上对poly(C)的作用又进行了大量的研究。 (JEV)的全长cDNA。为了验