Agouti在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中表达.pdfVIP

畜牧部分 161 Agouti在不同颜色被毛羊驼皮肤组织中的表达’ 姜俊兵“赵志军 贺俊平谢建山 董常生… (山西农业大学动物科技学院山西太咎030801) 摘要：哺乳动物毛色是一十多基因控制的·／生--R，Agoutl是研究哺乳动物毛色发生的一个主要的候选基因。A铲血基 因在羊驼毛色发生过程中是否表达厦其作用机理如何来见相关的研究报告。奉研究分别采用半定量RT—PCR技术和免 疫组化技术对白色和棕色被毛成年羊驼皮肤组织进行研究。半定量RT—PCR显示，Agouti基因在白毛羊驼皮肤组织中高 量表达．而在棕色毛羊驼皮肤组织中表迭量较低；免疫组织化学显示，棕色被毛羊驼皮肤组织毛囊外结缔组织中有少量的 A删d阳性着色，白色羊驼毛囊内根鞘有大量的Agoufi阳性着色，且形成了集中的Agouti特异性阳性着色圈。本研究结果 说明：Agouti基因在不同被毛羊驼皮肤组织中均有表达，在白色被毛羊驼真皮毛乳头表达的Agouti基因可能与白色被毛发 生相关。 关键词：Agouti；羊驼；半定量RT—PCR；免疫组织化学。 引言 两种类型，两者的相对数量与分布决定了哺乳动物表现出从白至黑多种颜色。关于哺乳动物毛色的发生 及机理历来受到广泛关注，在研究一种被毛黑白相问的豚鼠Agoua时发现一种基因与其毛色相关，后来这 种基因就被称为Agouti，随后在多种动物发现该基因，并且具有相似调节机制。Agouti是一种旁分泌的信 号因子，即Agouti信号蛋t3(agoufisignalingprotein，ASP)，由临近于黑色素细胞的真皮乳头细胞所分泌，作 用于毛囊微环境，阻止a一黑色素细胞刺激激素(Ⅱ一MsH)与其受体(MelanocorllnReceptorl，MCIR)的结合， 从而拮抗黑色素的产生“’2】。羊驼被毛颜色丰富，有关其毛色发生机制的研究尚属空白，Agoufi基因是否 在羊驼皮肤组织表达，未见研究报道。 1材料与方法 1．1材料 无菌手术取白色和棕色羊驼去毛皮肤0，5一1．5cm组织块，等分为两块，一块快速置于液氮冷冻保 存，用于总RNA提取；另一块用4％多聚甲醛固定，用于免疫组织化学分析。 1．2方法 1．2．1总RNA提取和反转录 取羊驼皮肤组织约0．19在液氮中迅速研磨至粉末状，小心加入1．5mL微量离心管，按照Triwl试剂 ·基金项目：国家自然科学蕈台资叻(项目编号No mall．eom ． 槲通讯作者：董常生(1952一)。男t教授，博导，Tel：∞54—6288208，E—mn：件d埘唱@㈣edu饥 162 2006学术年会 盒(Invitrogen)说明书要求分离总RNA，电泳检测完整性，紫外分光光度计法测定浓度。 用。 1．2．2反转录PCR扩增 板，借助Primer 3软件，设计一对扩增产物长度为200bp的引物，序列如下： 上游引物：5’一C1TIWFCCCCCACAAATIEA一3’ 下游引物：5’一GGCrGTA㈣GTGAGGAAG一3’ 试验选择目‘油醛一3一磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内标基因，引物参照文献㈨合成，扩增产物长度为 149bp，序列如下： 上游引物：57一CTGACCTGCCGCCIV)GAGAAA一3， 下游引物：5’一GTAGAAGAGlEAGlGTCGCIEIT一3’ 引物由大连宝生物工程有限公司合成。 1．2．3表达量统计分析 扩增产物上1．5％琼脂精凝胶电泳，利用捷达801凝胶图像采集与分析软件(3．3．1版)进行产物量扫 描分析。 1．2．4石蜡切片制备 取多聚甲醛固定的羊驼皮肤组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋，切片(厚度为5,um)，55。C烤 片过夜，贮存，准备免疫组织化学分析。 1．2．5免疫组织化学定位 30 rain。0．05％DAB／H202显色2—3 min，双蒸水冲洗，苏木素轻度复染、脱水、透明，流水浸泡lO．15血n返 蓝。梯度酒精脱水，透明，中性树胶封固。非免疫兔血清代替一抗作为阴性对照。 2结果 2．1 不同毛色羊驼皮肤组织中内标基因GAPDH的表达量 常使用的持家基因(house keepinggene)，在羊驼研究中同样可用，其在不同毛色及不同个体皮肤组织中的 表达量