胰岛素的体外表达.docVIP

生物化学实验 胰岛素蛋白质的体外表达 指导老师： 孙国鹏 班级： 生物技术（2） 成员： 曾祥玉 刘伟江 胰岛素蛋白质的表达 一 实验原理 利用基因工程技术及PCR技术，将胰岛素基因片段获取并插入质粒中，筛选得到带目的基因片段的质粒，注入微生物大肠杆菌中复制，将复制的质粒通过受体细胞表达出目的基因的蛋白质——胰岛素。 二 实验目的 了解基因工程的基本操作及应用。 三 实验器材 PCR仪器，4种核苷酸，大肠杆菌，受体细胞，质粒，逆转录酶，限制性内切酶，连接酶，小白鼠，注射器等，中间几步中所需器材及试剂省略。 四 实验步骤 （1）查找mRNA: 通过网路查找到胰岛素的mRNA， 如下是胰岛素的mRNA的有效序列： atggataa tctgtcatca gaagaaattc aacagagagc tcaccagatt actgatgagt ctctggaaag tacgaggaga atcctgggtt tagccattga gtctcaggat gcaggaatca agaccatcac tatgctggat gaacaaaagg aacaactaaa ccgcatagaa gaaggcttgg accaaataaa taaggacatg agagagacag agaagacttt aacagaactc aacaaatgct gtggcctttg tgtctgccca tgtaatagca taactaatga tgccagagaa gatgaaatgg aagagaacct gactcaagtg ggcagtatcc tgggaaatct aaaagacatg gccctgaaca taggcaatga gattgatgct caaaatccac aaataaaacg aatcacagac aaggctgaca ccaacagaga tcgtattgat attgccaatg ccagagcaaa gaaactcatt gacagctaa （2）目的基因的获得： 在胰腺中的胰岛素β细胞获得胰岛素的mRNA，通过逆转录过程，在逆转录酶的作用下获得cDNA片段，再运用PCR扩增技术将目的基因扩增，筛选出有用的目的基因。 （3）质粒和受体细胞的挑选： 质粒挑选，由于胰岛素表达后需要进行修饰才具有活性，我们需要选择真核表达载体。 受体细胞挑选，质粒的选择和受体细胞应相对应，原核质粒对应原核受体，真核质粒对应真核受体，则应选择与质粒相对应的真核受体。 （4）目的基因插入表达载体： 将目的基因与表达在同种限制性内切酶的作用下处理，处理后并用连接酶将目的基因与载体相连接。由于连接是随机性的，情况多样，需要将插入了目的基因的载体挑选出来。 （5）目的基因的复制和扩增： 将带有目的基因的载体转入大肠杆菌中，利用载体的抗性，进行有效的筛选并培养将目的基因复制。 （6）提取质粒载体并检测： 通过碱裂解法将含目的基因的质粒提取出来。碱裂解法师利用在NaOH和SDS溶液的作用下将大肠杆菌裂解，并将蛋白质和DNA变性，而质粒DNA能快速复性，将其分离的方法。 将提取出来的质粒DNA通过琼脂糖凝胶电泳下跑胶，在紫外灯观察DNA的存在。 （7）目的基因转入受体细胞及培养 感受态细胞制作，将受体细胞在CaCl2的处理下使细胞膜的通透性增加，通过热激处理让DNA进入受体细胞，通过抗性培养基筛选出带目的基因的细胞并培养，同时取出少量化平板保存。 （8）胰岛素蛋白质的获取及活性检测： 经上步培养后的细胞，将能把目的基因表达成蛋白质，且由于是真核细胞做受体，产生的目的蛋白是分泌蛋白，直接通过离心取上清也即可获得目的蛋白质. 目的蛋白活性的检测，胰岛素是一种降血糖的激素，是由胰腺中的胰岛β细胞产生的，在高血糖是，胰岛素将增加。当血糖较低是机体点出现休克状况，利用此原理检测胰岛素活性。 取三只生理发育状况良好的小白鼠，将小白鼠的胰腺除去，分别标记为一二三号，一号小白鼠注射生理盐水，二号注射提取出来的胰岛素蛋白质，三号注射具有活性的胰岛素，将三只小白鼠放入相同条件下，一段时间后观察小白鼠的生理反应。一号正常，三号出现休克状态，若二号小白鼠出现休克，则所提取的胰岛素具有活性，若二号小白鼠生理正常，则所提取的胰岛素不具备活性或为表达出来。