肌苷工程菌株的构建和其发酵条件的研究.pdfVIP

第二届全国发酵工程学术讨论会论文集1998 肌苷工程菌株的构建及其发酵条件的研究 陈宁李菁王树庆李颖张克旭刘淑云李干一． ‘天津轻工业学院食品工程系， 天津．300222) 摘要以肌苷生产菌BacJllussubtllis TF2为受体菌，利用质粒DN^的原生质体转化法，将 携带糖化型r淀粉酶基因的重组质粒pBx96导人TF2中，转化频率为5．7x10一，构建出一株能 件进行了研究，在最佳发酵条件下平均积累肌苷6．369／L． 关键词肌苷工程菌株，构建，发酵，均匀设计 肌苷被广泛应用于食品和医疗等方面．由于目前国内外的肌苷产生菌均不能直接 利用淀粉发酵生产肌苷．改变肌苷生产的碳源，直接以淀粉为原料发酵生产肌苷，将会 大大降低生产成本．本文采用原生质体转化法，将携带外源糖化型Gto淀粉酶基因的重组 (pBX96)。并对其发酵条件进行了研究，确定了发酵培养基组成．在最佳发酵条件下 平均积累肌苷6．369／L． 1材料与方法 1．1菌种 l s_+8一^G‘+6- 1．1受体菌：枯草芽孢杆菌(Bacillussubfilis)1B．遗传标记为ade一+hi MPl+SDl+Km5．天津轻工业学院代谢控制发酵研究室保存菌种． 基因和cm、Km抗性基因．Amy基因编码糖化型淀粉酶． 1．2培养基 pH7．2，O．IMPa灭菌20min． 1．2．2保藏培养基(％)：牛肉膏l0，蛋白胨0．4，酵母膏0．5，NaCl0．25，pH7．2，0IMPa灭 菌20min． 1．2．3肉汤培养基畅)：牛肉膏o．5，蛋白胨1．O,NaCl0．5，pH7．2—7．4，0．1MPa灭菌20min． 2， 0．1MPa灭菌20min． 0．2，pH7．2，0．IMPa灭菌20min． 1．2．6发酵培养基似)：可溶性淀粉10，药用酵母粉3．0，玉米浆0．5，(NH4)zS040．2， MgS040．15，尿素0．3，CaC03 2．0，pH7．0，0．1MPa灭菌20min． 1．2．7SMM、SMMP、PAB、40％PEG6000、DM-3再生培养基：见文献1． 1．3方法 1．3．1pBX96质粒的提取：见文献【3，4】． 1．3．2原生质体形成、转化及再生：见文献【2，5】． 1．3．3原生质体形成率、再生率及转化频率计算：受体菌计数为A，未形成原生质体的菌 体计数为B，DM--3再生平板菌落计数为C，转化子计数封D，按文献【6】，原生质体形成率 一(^咄)／Bxl 1 3．4质粒检测：见文献【6】6． 1．3．5转化子阳性菌落的检出：以LBS+Km平板通过I 2-KI试荆显色检出． 第二届全国发酵工程学术讨论会论文集 1998 水解可溶性淀粉产生1retool／L还原糖的酶量为一个单位． 1．3．7菌体浓度测定 (1)单个细胞平均质量的测定：取一环活化菌种于肉汤培养基中，每隔～定时间取样．取 15min，将湿菌体在100—105℃下烘干，测得菌体干重(g)． 单个细胞平均质量(g价)=菌体干重／5×活菌数A (2)发酵过程菌数测定：在发酵过程中，每隔一定时间取样lml，以10倍连续稀释法测活菌 数(B个^n1)． (3)菌体浓度测定 菌体浓度(e,／L)=单个细胞平均质量xBxl000 33斗37·40℃振荡培养72h． 1．3．9淀粉含量的测定：采用斐林法． 1．3．10肌苷含量的测定：采用离子交换法pJ，用751一G型分光光度计进行测定． 1．3．11质粒稳定性的测定：取发酵液(或种子液)，用生理盐水适当稀释后，在LB固体培养 100％． 率p=(100一A)