基因工程整理版.docVIP

基因： 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目的的技术。 纯化时常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇；乙醇沉淀的方法去除抽提过程完成后的水溶液中痕量的酚、氯仿，浓缩DNA，更换缓冲液。 PCR: PCR反应原理：变性、复性、半保留复制 PCR三步曲：变性退火延伸 PCR反应体系：模板 DNA， 反应缓冲体系 ， dNTPs， 引物， DNA polymerase ， ddH2O 到第3个循环才有目的片断（指用长DNA作为模板）. 进入平台期的原因: 反应试剂用完 产物之间相互退火 Taq酶活性降低 优化PCR反应：引物的退火温度. Mg2+ 的浓度. 延伸时间. 模板和Taq的量 TA克隆：Taq扩增PCR产物物末端加个A； 可以与末端为T的载体直接连接 　　　引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(3) 四种碱基应随机分布,在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7) 引物5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 Southern Blot原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 Southern Blot 操作步骤：DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 应用：检测样品中的DNA及其含量 了解基因的状态(点突变、扩增重排等) Northern Blooting：用于分子生物学的研究来研究基因的表达检测核糖核酸(或孤立的mRNA)。涉及使用电泳分离RNA样本大小和检测的与杂交探针互补的部分或整个目标序列。 步骤：1 RNA电泳（包括制备变性胶和RNA样品的处理） 2 转膜 （把RNA从胶上转移到膜上） 3 杂交 （用标记同位素的DNA探针与膜进行杂交） 4 洗膜、曝光、冲片 Northern blot 作用：RNA与DNA探针的杂交 功能： 1 分析mRNA的分子量大小 2 分析mRNA表达量 3 分析mRNA表达的组织分布 4 分析mRNA的发育表达变化 5 研究mRNA的不同剪切方式 Western Blot：是一个被广泛接受的分析技术用于检测特定的蛋白质在给定的样本组织匀浆或提取。 它使用凝胶电泳分离蛋白质的三维结构或本地变性蛋白质多肽的长度。蛋白质是然后转移到膜(通常是硝基乙烯),在那里他们沾着特定的靶蛋白的抗体。 Western blot 分析：蛋白与蛋白的杂交，如蛋白与抗体的杂交 功能： 1 分析蛋白的分子量大小 2 分析蛋白表达量 3 分析蛋白表达的组织分布 4 分析蛋白的发育表达变化 5 研究蛋白前体的后加工方式 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来