4实验四细胞器的分离.pptVIP

* 细胞器的分离 实验四 一、实验目的 了解用差速离心的方法分级分离细胞组分的原理和过程。 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。 二、实验原理 细胞内各种结构的密度、形状、大小各不相同，因此它们在同一离心场内的沉降速率就不相同。而且在进行沉降时各自要求的离心力也不相同。差速离心的方法就是根据这一原理，利用不同的离心速度所产生的离心力，将各种亚细胞组分和颗粒分别分离开。当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；加大离心力后，又可分离出线粒体：离心力再加大，又能分离出微体和核糖体。 除了差速离心法，还可也使用在差速离心法基础上改进产生的密度梯度离心法来进行细胞亚组分的分离。这一方法是使离心溶液含有密度逐步增加的（密度梯度）极易溶解的惰性物质，例如蔗糖，利用这一密度梯度来维持重力的稳定性和抑制对流。操作时，将细胞匀浆液置于离心管的最上层，随后离心，这样，不同大小、形状、密度的细胞结构，由于它们的沉降系数不同，就会以不同的速率向下移动，分别集中到相应的密度区带而得以分离。 载玻片 约1/4处，滴加液滴 图示：涂片制作过程 用另一玻片轻触液滴前端 三、实验步骤: 蛙肝 ↓冷生理盐水10ml洗，吸干水分，放在小烧杯中 ↓加入预冷蔗糖液(少于9ml)，剪碎 匀浆 ↓纱布过滤 滤液→做涂片① ↓2000 rpm离心10 min 沉淀 上清液 →作涂片② ↓加预冷蔗糖液至8ml，吹打均匀 ↓11000 rpm离心10 min，弃上清液 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心10 min，弃上清液 ↓加预冷蔗糖液，吹打均匀 沉淀 混合液 ↓加1ml蔗糖液，混匀 ↓11000 rpm离心10 min 作涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 取少许于载片, 取1滴于载片 加健那绿B 混匀④ 加健那绿B 混匀⑤ ①、②、③片，自然干燥后，放入Giemsa染液缸中染色5min，用蒸馏水洗去染液，镜检。 ④片先滴1—2滴健那绿B于玻片上，挑少许沉淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 ⑤片先滴1—2滴健那绿B于玻片上，滴一滴上清液在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。 作业 描述鉴定观察的五张片子的结果。 纱布过滤，还需要准备漏斗。 需要的冰。 一、实验仪器 每组（两人） 匀浆器一个，大小烧杯各一个，5ml和15ml离心管各两支，小漏斗一个，纱布一块（用完后要清洗备用），低速离心机（郑冰蓉老师处借来）和高速离心机11000rpm。 二、实验药品 生理盐水或（蛙的为0.65%），蔗糖溶液（0.25Mol/L蔗糖和3mMol/LCacl2配制成蔗糖缓冲液），健那绿B，吉姆萨