琼脂糖胶和PAGE胶制备方法.pdfVIP

中国试剂网 2.4.36 琼脂糖胶和PAGE 胶制备方法 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（agar ）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80 ％）及琼脂 胶（agaropectin ）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电 荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在 电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳 速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如 下。 （1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电 泳。 （2 ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98 ％~99 ％），近似自由电泳，样品 扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 （3 ）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测 定。 （4 ）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免 疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由 于建立了超微量技术，0.1ug 蛋白质就可检出。 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA 鉴定，DNA 限制性内切核 酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高， 已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 二、DNA 的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子 构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 （1）DNA 分子的大小 在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对 数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比 较，便可测出未知片段的大小。但是当 DNA 分子大小超过20kb 时，普通琼脂 中国试剂网 2.4.36 糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用 琼脂糖凝胶电泳分离DNA 时，分子大小不宜超过此值。 （2 ）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA 需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离。 表 琼脂糖浓度与DNA 分离范围 琼脂糖浓度/ 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 ％ 线状DNA 大60 －5 20－1 10－0.8 7 －0.5 6 －0.4 4 －0.2 3 －0.1 小/kb 2 、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA 的移动速度次序为：供价闭环DNA （covalently closed circular， cccDNA ）直线DNA开环的双链环状DNA 。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA （一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0 （Rm=0 ），而同等大小的直线双 链 DNA （刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm0 ），由此可见，这三种构型的 相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等 的影响。 3、电泳方法 （1）凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电 泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下 1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用 的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需 要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。 （2 ）缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA 迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流 太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA 的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA （pH8.0 ）和Tris- 乙酸（TEA ），Tris-硼酸（TBE ）或 Tris-磷酸（TPE ）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成 浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 TAE 缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE