新江艾比湖嗜盐菌的细菌视紫红质与16SrDNA基因序列的研究.pdfVIP

新疆艾比湖嗜盐菌的细菌视紫红质和 16SrDNA基因序列的研究‘ 旭格拉·哈布丁。迪丽拜尔·托乎提。吴敏@周培瑾@ (新疆师范大学生命与环境科学学院)@ (浙江大学生命科学学院)。 (中国科学院微生物研究所)国 摘要：从40份土壤，湖水及淤泥样品分离出148株嗜盐菌，为了研究分析嗜盐古生 茵物种与细茵视紫红质(BR)蛋白基因资源，对其中6株茵采用聚合酶链式反应 (PeR)方法对其编码螺旋c至螺旋G的蛋白基因片段和16SrDNA基因进行了扩增， 并测定了基因的核甘酸序列。与已报道的相应片段进行对比，ABDHll中的螺旋C 至螺旋G的蛋白与其他菌株差异显著．基于16SrDNA序列的同源性比较以及系统 GenBank中。 关键词：嗜盐古生菌；细菌视紫红质；16SrDNA；系统发育 248个氨基酸组成，分子量约为26kD，第216位的赖氨酸通过希夫碱基和生色团视黄醛 分子相连【l】。并以7个a螺旋的基本二级结构跨膜定位于嗜盐菌的质膜上啪。天然状态下， 每3个BR单体组成三聚体，构成六角形二维晶格的膜片层．紫膜(purplemembrace，pm)。 对它的深入研究，有助于细胞膜信号传导途径中膜蛋白受体作用机制与传导模型；同时 BR又是细胞膜上离子通道的原型蛋白，其跨膜转运质子的机制可以为其他离子通道蛋白 结构功能的研究起到指导性作用；在太阳能电池、人工视网膜、光信息储存、神经网络、 生物芯片等应用领域中BR的光电响应和光致变色特性有着广阔的利用前景。因此，将野 外分离的BR和人工改造的BR蛋白用于研究BR结构和功能，并结台晶体学研究，阐明 其光反应和质子泵机制，已成为目前BR蛋白研究中的一个熟点跚。 我们在新疆北部艾比湖中分离纯化得到的嗜盐菌ABDHl0和ABDHll的生长盐浓度 rRNA基因(16S 范围在20％～25％，基于16S rDNA)序列进行了系统发育分析，随后 扩增了菌株ABDHll的BR蛋白自螺旋C至螺旋G的基因保守片断，并同已报道的其他 菌株相应的BR蛋白序列进行了氨基酸相似性析。 ，基金项目：国家自然辩学基金资助(3006001)项目自治区特批基叠2002-10项目 一、材料和方法 1．菌株 由复旦大学生命科学院李庆国教授惠赠。 2．分离和培养 菌种分离和富集培养采用高盐培养基，配方如下：2009NaCI，209MgS04·7H20，39 柠檬酸钠t 29KCI，o．29 一培养基加琼脂209。 土样先用高盐培养基悬浮，再取少量悬浮液加到液体培养基中；冰样解冻后取少量 加到液体培养基中；水样直接取少量加到液体培养基中，37℃光照振荡培养7d。适当稀 释涂布平板，经反复划线纯化，直至获得单菌落。 3，基因组总DNA的提取 DNA提取方法参见文献{4】。 4．PCR扩增 根据文献”“1报道的已知16SrDNA序列，使用DNASTAR软件设计一对引物， u PCR反应条件为501反应体系30个循环；变性；94℃，45s：退火：50。C，45s：延 伸：72℃，90s。 u CCGACCTf一3’。PCR反应条件为：501反应体系30个循环；变性：94C，30s；退火： 55。C，30s；延伸：72C，30s。 5．DNA序剜的转化和测序 PCR产物用直接T／A克隆法进行克隆，先将该片段纯化，连接到质粒pUCm-T上， 再转化到大肠杆菌JMl09菌株，在含氨苄霉素((AMP+)的平板生长过夜，挑选自斑， 经PCR和酶切验证后，随机取3个阳性克隆测序。 6．系统发育树的构建 rDNA序列， 将菌株ABl的16SrDNA序列与从GenBank数据库中获得的嗜盐菌16S 采用Clustalwl．8软件包进行多序列匹配排列，其中形成的缺口用中性元素填补。用PHYLIP 程序包中的DNAdist程序计算进化距离，根据“Kimura双