外源基因转染哺乳动物细胞的实验设计.pdfVIP

外源基因转染哺乳动物细胞的实验设计 一、实验目的： 此实验为细胞生物学综合性实验，目的是让学生学习和掌握细胞的传代培养 技术，学习和掌握细胞冻存和复苏的方法，学习和掌握外源基因导入真核细胞的 主要方法；熟悉转染的原理；了解外源基因进入细胞的方法，观测外源蛋白的表 达（绿色荧光蛋白），并统计转染效率。 二、实验内容 实验内容如下： 整个实验分为四个板块：1.细胞的复苏与冻存，2.细胞传代培养，3.外源基 因转染细胞,4.检测转染效果 1.细胞的冻存和复苏 仪器：C02 培养箱，倒置显微镜，微量移液器，吹打管，血球计数板，培养 瓶，移液管，废液缸，超净工作台，离心机，离心管，冻存管，75 ％酒精棉球， 0 0 4 C 冰箱，-80 C 冰箱，液氮罐，水浴锅，500mL 烧杯，胶布。 试剂：培养基，胰蛋白酶，血清 PBS，医用酒精，二甲基亚砜(DMSO)，0.5 ％ 台盼蓝染液，液氮。 方法步骤： (一)细胞冻存 1. 先用70% 的酒精泡的酒精棉擦拭超净台台面； 2. 将处理细胞所需要的培养基、血清、胰酶消化液、细胞吹打管、移液管、 细胞培养皿、离心管、洗耳球、废液缸及酒精灯放到超净工作台内； 3. 按下超净台的紫外灯开关，打开紫外灯管，照射台面30min 左右； 4. 打开CO2 培养箱门，取出装有正常培养的细胞的培养瓶； 5. 将细胞培养瓶放置在倒置显微镜下，调节显微镜的粗、细准焦螺旋，找 到细胞焦平面，观察细胞形态及细胞密度；待用； 6．紫外灭菌结束后，打开风机，关闭超净台的紫外灯，打开照明灯； 7 ．点燃酒精灯，取出吹打管和移液管，在酒精灯上烤一下管口，安上洗耳 球，管尖也要在酒精灯上烤一下，放在右手边，管口附近要放一个小支架，避免 管口挨到台面； 8. 培养基，血清，胰酶消化液的瓶子都要在酒精灯上烤瓶盖，打开瓶盖后， 瓶口也要在酒精灯上烤一下； 9. 将细胞培养瓶（步骤5 中观察的培养瓶），在酒精灯上烤瓶口，然后打开 瓶盖； 10. 用移液管吸出细胞培养瓶中的培养基，放入废液缸； 11．换一新的移液管吸取胰酶消化液，加入培养瓶中，将细胞培养瓶平放在 超净工作台上（静止放置即可），消化 3-5min （时间以对话框的形式填写），观 察细胞不再像正常状态紧贴培养瓶壁时，用吹打管吸胰蛋白酶液反复吹打细胞。 12．将吹打下来的细胞连同消化液转移到离心管中，盖好离心管盖，放在离 心机中，1000rpm 离心5min ； 13. 用吹打管吸取上清液，将上清液放入废液缸； 14. 用移液管加入将细胞冻存液（细胞冻存液：10%DMSO+20%血清+70%完 全培养基），以细胞冻存液混合细胞，调节细胞浓度至1-5X106 个／mL； 15. 用移液管将细胞悬液分装到细胞冻存管中，做好标记； 16．将冻存放入程序性降温盒中，将程序性降温盒放入-80℃冰箱中，4—12h 0 后即可转移到液氮内(-196 C) ； (二)细胞复苏 1. 调水浴锅至40 ℃左右； 2. 从液氮罐中取出冻存管立即投入40 ℃水浴锅中迅速解冻； 3. 将冻存管放入离心机中，1000rpm，离心5min ； 4. 用吹打管吸取上清液，将上清液放入废液缸； 5. 向冻存管中加入新鲜培养基，用吹打管反复吹打细胞使分散； 6. 用吹打管将上一步的细胞悬液转移至细胞培养瓶，加入新鲜培养基； 7. 将细胞培养瓶迅速放入C02 培养箱中培养； 8. 4h 后，在倒置显微镜下观察细胞状态，如果死细胞较多，次日应更换培 养液； 9. 待细胞长满后，可进行细胞传代培养。 2.细胞传代培养 仪器：C02 培养箱，倒置显微镜，微量移液器，吹打管，血球计数板，培养 瓶，移液管，废液缸，超净工作台，离心机，离心管。 试剂：培养基 胰蛋白酶 血清 PBS 医用酒精 方法步骤： 1．先用70% 的酒精泡的酒精棉擦拭超净台台面； 2．将处理细胞所需要的培养基、血清、胰酶消化液、细胞吹打管、移液管、 细胞培养皿、离心管、洗耳球、废液缸及酒精灯放到超净工作台内； 3