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共聚焦激光扫描显微镜在发育生物学中的应用 饶丽萍 生物技术121班 共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）是生物医学领域分析细胞结构和功能强有力的研究工具。近些年来，随着相关技术的发展，共聚焦显微镜的应用在发育生物学中的使用越来越广泛（图表1）。发育生物学领域共聚焦激光扫描显微镜常用于卵母细胞/精子/胚胎的连续光学切片,横断层成像及三维重组的研究中。哺乳动物的配子和受精卵体积较小，需要进行整体观察。受精后和胚胎植入前，胚胎细胞数目众多，细胞发出的荧光会干扰图像的分辨率，传统的荧光显微镜很难对胚胎进行整体观察。CLSM则通过消除非焦平面的荧光提高分辨率，可对配子和受精卵进行整体观察，并将形态观察和功能检测结合起来。 本文论述了共聚焦激光扫描显微镜在早期胚胎发育过程中的形态学和功能学研究。形态学研究包括： 细胞骨架（微丝、微管/纺锤体）和细胞器（线粒体）的观察，功能研究包括：皮层颗粒的定位和功能、细胞凋亡。形态和功能特征的分析对：1）检查卵母细胞、精子和胚胎正常的结构和组成，2）观察卵母细胞核的状态和发现非整倍体，3）分析参与卵母细胞成熟的细胞因子，4）评价受精卵的质量等是非常重要的。本文主要描述CLSM在小鼠和人类配子和胚胎研究中所取得的结果。 激光扫描共聚焦显微镜的原理 激光扫描共聚焦显微镜是由普通荧光显微镜和共聚焦系统组成的。扫描激光经过显微镜光学系统聚焦到目标样品上，形成微米级光斑，该光斑正置显微镜物镜焦点所在，这也是激光扫描共聚焦显微镜“共焦”的本质含义。LSCM利用生物体自身或特定染料标记后被激光激发发出荧光，激光荧光通过显微镜的光学系统及有关光学元件，输送到光电倍增管，光学信号经进一步处理，转换成样品图像[1]。LSCM不仅可以观察单一层面的高清晰荧光图像，还可以借助于计算机软件将各个层面的图像作三维重建，直观地观察真实的三维结构[2 3]。 共聚焦激光扫描显微镜在形态学研究中的应用 2.1微丝 肌动蛋白可以通过单克隆或多克隆抗体标记的免疫组化方法进行观察。另外，肌动蛋白也可以用鬼笔环肽来标记。CLSM可用来检测卵母细胞细胞骨架成分的正常分布和观察卵母细胞与颗粒细胞之间的锥形突起。中期Ⅱ卵母细胞中微丝主要位于皮层区域，覆盖中期纺锤体。 精子发生期，配子细胞中的微丝主要位于精子前顶体的圆形区域和伸长的精子细胞中，肌动蛋白对精子头部形成和维持精子完整性起着重要作用。肌动蛋白丝去极化后将无法观察，但是使用CLSM观测到在小鼠精子头部后极体和核周膜、人类和小鼠精子的中段和颈部区域及小鼠精子尾的中部和前部片段仍有单体或者低聚体的肌动蛋白。 CLSM常用来观察胚胎微丝的分布和卵裂球的状况及计数卵裂球的细胞数量，这是评价胚胎质量的一种方法。受精后，微丝逐渐聚集在降解的精子细胞核周，形成结合圆锥，在原核周围可以观察到微丝。受精卵中，微丝位于细胞内皮层，Levy等[4]发现在所有高度分裂的胚胎和一些冷冻人类胚胎中, F-actin是杂乱无章分布的, F-actin在早期人胚羊膜各层内表达也有差异[5]。 2.2微管/纺锤体 荧光单克隆或多克隆抗体及一些药物已用来研究微管的结构功能。秋水仙素（Colchicine）与微管蛋白分子结合, 阻止其聚合。紫杉醇（Taxol）促进微管蛋白聚合,具有稳定微管的作用。 目前使用CLSM在微管/纺锤体方面研究的热点是: 卵母细胞微管和纺锤体的组装,卵母细胞的受精过程和受精卵的早期发育,衰老与纺锤体和染色体的影响,冷冻保存对卵母细胞的影响。 CLSM用来评估母体年龄对减数分裂纺锤体的影响，通过对比年轻和衰老的人类和小鼠胚胎纺锤体的质量，发现衰老对微管的结构和再利用有影响，并与人类卵母细胞中纺锤体和染色体异常有关[6]。CLSM也已用来研究纺锤体状态与治疗的关系。对人类GⅤ和MⅡ期冷冻保存的卵母细胞进行分析[7]，发现冷冻保存不会影响纺锤体/微管体外继续成熟的能力,但会引起结构稍微异常。通过研究α和γ管蛋白的分布，显示冷冻卵母细胞到4℃会引起纺锤体的解体。α和β-管蛋白（微管，纺锤体）、γ-管蛋白（环绕在纺锤体的两极）和中心粒旁物质在人类或小鼠胚胎中的免疫定位有助于研究有丝分裂纺锤体的形态结构、定位，因为减数分裂期染色体有序排列是由微管在纺锤体内的装配决定的。 2.3线粒体 线粒体特异荧光探针已用来检测线粒体的功能和形态，罗丹明123可以检测活性线粒体的跨膜电位。Mitotracker具有较强的耐光性，在细胞固定后仍能完好保留线粒体在活细胞中的荧光染色特征。在人类，线粒体的活性可能与卵母细胞发育结果有关，线粒体定位异常有助于理解不育和发育阻滞的可能原因。卵母细胞内有大约10万个线粒体。GⅤ期,线粒体杂乱分散在卵母细胞中,