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病毒学的研究方法 分离技术 电子显微镜技术 组织和细胞培养技术 血清学方法 分子生物学方法 1、机械分离 过滤分离：过滤介质 固体颗粒大小 沉降分离：重力作用 密度差 离心分离：离心力 密度差 旋风分离：惯性力 密度差 静电除尘：静电场 使细颗粒带电 离心 常用于病毒的纯化 3、反应分离 可逆反应（如离子交换、反应萃取）；不可逆反应（反应吸收、反应结晶）；分解反应（生物分解、电化学反应、光化学反应）等。 二、电子显微镜技术 技术方法 负染色法 超薄切片技术 免疫电镜技术 冷冻电镜技术 三、组织和细胞培养技术 指从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。 1、组织培养的原理 组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生长繁殖的能力。 细胞病变效应（CPE） 由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变效应。 3、细胞培养的基本条件 细胞接种数：接种传代细胞一般为10—30万/ml 合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagle’s MEM。 酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。 温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致。 无菌条件 培养器皿的处理 4、组织培养的优缺点 优点：可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，对疫苗生产来说，其抗原性更接近于自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反应。 缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易使病毒滴度丢失，传代细胞含致癌因子，不宜用于疫苗生产。且随着细胞代数增加，对病毒敏感性也随之下降。 四、血清学方法 中和试验：适用于病毒鉴定，机体中抗体的检测，分析病毒抗原的性质，疫苗接种效果评估等 补体结合试验 血凝抑制试验：常用于正粘病毒和副粘病毒感染的诊断和病毒亚型鉴定及抗原变异的监测，如流感病毒的分型 酶联免疫吸附试验 放射免疫试验免疫荧光检测 五、病毒学研究常用方法 聚合酶链反应（PCR） 转印杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot 蛋白质组学：肽图谱 基因组学：核酸序列测定及基因功能 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽 、病毒载体 * * 图1.1 混合物分离 原料（混合物） 残余物 分离设备 分离剂 产 品 进一步综合利用 一、分离技术 机械分离 传质分离 分类 反应分离 特点：相间无物质传递 A:等速度沉降，B:等密度沉降 2、传质分离 平衡分离过程： 蒸发、蒸馏、吸收、萃取、结晶、离子交换、吸附、干燥、浸取、泡沫吸附等 传质分离 速率控制分离过程： 气体扩散 热扩散 电渗析 电泳 反渗透 微滤、超滤和纳滤 1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。 肌动蛋白纤维的负染电镜照片 用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色。 1、负染色法 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差. 莱卡超薄切片机 2、超薄切片技术 冰冻蚀刻,亦称冰冻断裂。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构. 3、冰冻蚀刻 人冠状病毒（左）与SARS冠状病毒 病毒粒子三维重构模型 电镜观察发现痘病毒是整个病毒粒子通过吞噬作用进入细胞的 群体培养（左）和克隆培养（右） 群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。 克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。 2、细胞培养技术 原代和次代细胞培养：分离病毒最为敏感 二倍体细胞 ：用于病毒分离和疫苗制备 传代细胞系 ：用于病毒的分离鉴定和抗病毒药物筛选研究。 病毒基因转染细胞系：用于病毒基因调控和抗病毒药物的研究。 常用的细胞培养 *