分离工程第七章.ppt

第七章 亲和纯化 生物亲和作用 生物物质，特别是酶与抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力；这种识别并结合的能力具特异性，即能够区分结构和性质非常相近的不同分子，选择性地与其中一种分子结合。 生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用。 通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。 亲和纯化技术 定义：利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术。 应用：通常与其他分离纯化技术相结合，如亲和层析技术、亲和膜分离技术等。 第一节 基本原理 一、亲和作用的本质 参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。 蛋白质参与亲和作用的机理 一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点，呈凹陷或凸起结构。 同时，具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。 生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是亲和作用特异性高的主要原因。 二、亲和作用体系 生物物质中常见的亲和作用体系有： 酶与其底物；含有糖基的酶或蛋白质分子通过糖基与植物凝集素结合；酶或蛋白质作为抗原与其抗体结合等。 外源凝集素是一种天然蛋白质，大多数可由植物中制取，外源凝集素具有类似抗体的活性，并于一些糖的残基或链段。有高度的亲和力，广泛用于糖蛋白，糖多肽，多糖化合物以及糖脂的检测，分析 和纯化。 在亲合层析分离中，它们与层析剂结合，可用来分离整个细胞、细胞表面受体蛋白、细胞膜片段及各种含糖配基的生物大分子物质。 亲和作用体系的特异性 高度特异性体系：一对一关系，如抗原与其单克隆抗体的结合。 群特异性体系：大多数亲和体系，如外源凝集素可与任何含有糖基的蛋白质结合。 三、亲和纯化原理 将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子（目标物质）容易从混合物中得到选择性分离纯化。 亲和配基：亲和作用分子对中被固定的分子。 结合常数 E＋L = E·L 其中：E、L和E·L分别表示目标物质、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104~108dm3/mol，太大洗脱回收困难，太小则难于有效吸附目标物质。 第二节 亲和层析 一、原理与操作 原理 利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。 操作 包括进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。 洗脱方法有 特异性洗脱 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过竞争性结合作用，脱附目标产物。 相当于顶替展开 特点：条件温和，有利于保护目标产物的活性和提高纯度。 非特异性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，使之脱附。 是较多采用的洗脱方法。要求操作对目标产物活性无影响。 二、亲和吸附介质 一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基修饰固体粒子，制备所需的亲和吸附介质。该固体粒子通常称为配基的载体。 亲和配基：可选择的有酶的抑制剂、抗体、A蛋白、凝集素、辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色素、过滤金属离子、组氨酸和肝素等。 对载体的要求 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。 亲和吸附载体的种类 常用制备亲和吸附介质的方法有：CNBr活化法、环氧基活化法和硅胶的活化。 载体的活化和偶联 亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化，活化的方法主要有： 溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐 高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺 环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联 甲苯磺酰氯法：双功能试剂法 二乙烯砜 环氧化法 配基偶联方法 载体经活化后，就可以进行与配基的偶联反应。具体方法如下： 碳二亚胺缩合法(脱水) 酸酐法 叠氮化法 重氮化法 三、应用 最初用于蛋白质特别是酶的分离和精制上，后来发展到大规模应用在酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。 思考题：制备亲合吸附介质时，为什么需要在配基与载体之间引入间隔臂？ 第三节 亲和膜 一、原理 利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜亲和层析。 微滤膜比喻为固定床，则膜厚即为床层高度。亲合配基固定在膜孔表面。流体在透过膜过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。 二