质粒DNA的提取、酶切及目标序列的PCR扩增.docVIP

******大学 教学实验报告 实验项目名称：质粒DNA的提取、酶切及目标 序列的PCR扩增 实验项目性质： 综合性实验 计 划 学 时： 课程实习 班 级： 姓 名： 学 号： 指 导 教 师： 2010 年 5 月26日 摘 要 本实验通过碱裂解法提取并纯化大肠杆菌DH5α（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）中的质粒DNA，并对该质粒DNA进行双酶切及目标序列的PCR扩增，学习并掌握基因工程操作中最常用的载体质粒DNA提取方法及其纯化技术、DNA酶切分析实验的基本操作和PCR实验操作技能，理解限制性内切酶的特点，加深对聚合酶链式反应的原理的理解。结果显示，提取的质粒DNA量较多，且含有插入目的片段，但仍伴有大分子DNA碎片，提取纯化质粒DNA的操作有待提高。本文为基因工程中质粒DNA提取和纯化等提供一定的参考价值。 关键词：质粒DNA 双酶切 PCR 前言 质粒 ( Plasmid)是一种染色体外稳定的遗传因大小从 1～200 kb不等为双链闭环的 DNA分并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要放线菌和真菌细胞中它具有自主复制能在子代细胞中保持恒定的拷贝并表达所携带的遗传信息它可将有用的外源基是分子生物学试验中常用的工具[]。 质粒DNA 是基因工程的常用载体大肠杆菌因其易操作发酵周期短备受分子生物学工作者的青睐大肠杆菌质粒DNA 的提取成为分子生物学实验中最基础和最重要的工作质粒的质量关系到分子克 ,常[3-4]、煮沸法等还有许多改进的方法报道(如贺竹梅[]、李云峰[]等)。同时各试剂公司也开发出多种质粒提取试剂盒。本文以碱裂解法提取质粒DNA并进行纯化，分别以双酶切与PCR技术检验提取的重组质粒中是否含有插入的目的片段。 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验材料 大肠杆菌DH5α（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性） 实验试剂 LB培养基，3mol/L醋酸钾（pH5.2），TE缓冲液（pH8.0），无水乙醇，75%乙醇，RNaseA（10mg/ml），goldview DNA染色剂，氯仿，琼脂糖； BamHI（1 U /μL）、HindⅢ（1 U /μL）、10×K buffer、6×上样缓冲液、0.5×TBE等； 1U/μL的 Taq酶，10 × PCR buffer，1 mmol/L 的dNTP，克隆基因特异引物F1、F2（各1μmol/L），marker DNA，ddH2O。 抽提质粒DNA所需的溶液： 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)； 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用； 溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2； 电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0； PCR扩增引物： PF：5`—CCAAATGGTTGTATGGTGTT—3` PR：5`—CTATCCAACAATCTTGGAAA—3` 实验仪器 高压灭菌锅，超净工作台，恒温摇床，台式离心机，涡旋振动器，培养管，移液器，1.5ml的离心管，吸管头， 0.2ml的PCR管，PCR仪，冰盒，量筒，制胶模，电泳仪，紫外观测仪等。 实验方法 2.2.1 碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化 （1）质粒DNA的提取： ① 在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜； 取1mL菌液放入1.5mL Ep管中，5000 r/min（简写rpm）离心2min；弃尽上清； 加入150μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀，悬浮菌体； 加入250μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌； 加入180μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－80℃放置5min； 12000rpm离心8min； 吸上清550μL至另一新的1.5mL EP管，加等体积氯仿充分混匀，12000rpm离心5min； 小心移取上清液150μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-80℃静置10min，12000 rpm离心5min，弃上清； （静置期间制1%琼脂糖凝胶） 加入300μL 70%乙醇洗DNA沉淀，弹离心管壁至DNA沉淀悬浮，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心1min，用移液器尽可能除去乙醇，通风橱适度风干； 加入30μL RTE （含20μg/mL RNase