巨噬细胞的原代培养.docVIP

1 原理 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。2试验材料 昆明种小鼠 10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡 1只PRMI1640培养基新生小牛血清HEPESD-Hanks液青霉素链霉素3试验仪器无菌操作台 手术刀 解剖剪 解剖镊 止血钳 5m注射器 注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。二氧化碳培养箱生物显微镜高速冷冻离心机低温冰箱4实验步骤4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法:将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。培养液的无菌处理：(1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。(2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4冰箱中备用。(3)将新生小牛血清200m1，在56水浴中灭活30分钟，按10%的浓度分别加入培养液中备用。4．2巨噬细胞的获取4.2.1 以颈椎脱臼法处死小鼠。 4.2.2 手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中5min，倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至4PRMI1640培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3min，静置5～7min。 4.2.3 置小鼠于解剖台，用针头固定四肢，在腹股沟区作一横切口，撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁， 但勿伤及腹膜壁。用75%酒精冲洗腹膜壁4.2.4 用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并 促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液。 4.2.5用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 4.2.6小心拔出针头，把腹腔液注入预冷的培养瓶内。4.2.7常规计数细胞。每只鼠可产生2~ 3×106/ml细胞，其中90%为巨噬细胞 。取少量细胞悬液做Giemsa染色，在光镜下观察以鉴定是否是巨噬细胞。4.3巨噬细胞的纯化将细胞悬液于4、1000r/min离心10min,弃上清,放入培养瓶中，将培养瓶中细胞用4D-Hanks液洗2次,再用RPMI1640培养液于37、5% CO2 下培养2h,弃上清,用D-Hanks液洗涤2次以洗去未贴壁细胞,贴壁的细胞则主要是巨噬细胞。然后换下培养用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液培养继续培养，此时将得到接近纯净的巨噬细胞。4.4巨噬细胞的接种和培养将纯化的巨噬细胞培养瓶快速冷冻至2，待细胞收缩后猛摇或吹打培养瓶，使巨噬细胞从瓶壁上脱落下来（Castranova et al.1996）。制成细胞悬液后，计数并调节细胞密度。以2×105 ～4×105个/cm2的密度接种细胞于12孔培养板内，加入适量RPMI1640培养液后置于37、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液