大鼠腺苷酸环化酶活性测定.docVIP

中国协和医科大学 基础医学教案 教 研 室：药理室 课程名称：药理学 教师姓名：郭 磊 教师职称：讲 师 授课题目： 大鼠腺苷酸环化酶活性测定 授课对象： 八年制医学专业学生。 授课学时: 5学时。 教学目标： 1.学习非标记底物(ATP)法测定腺苷酸环化酶(AC)活性的方法以及竞争性蛋白结合法测定cAMP的技术。 2.了解多巴胺受点与腺苷酸环化酶的关系，说明神经松弛药作用的部分机理。 教学内容: 原理。 实验方法。 结果处理。 重点: 腺苷酸环化酶活性的测定方法。 难点: 加样要精确，防止同位素污染。 评价手段: 实验操作及实验报告。 参考资料: (备课用) 药理教材及实验讲义。 教学目标 教学内容 教学方法 时间分配 备注 1.掌握非标记底物(ATP)法测定腺苷酸环化酶(AC)活性的方法以及竞争性蛋白结合法测定cAMP的技术。 2.了解多巴胺受点与腺苷酸环化酶的关系，说明神经松弛药作用的部分机理。 (一)原理: 非标记底物法测腺苷酸环化酶 (二)实验方法: 大鼠尾状核匀浆置备:取大鼠脑尾状核加Tris苹果酸缓冲液。 腺苷酸环化酶活性反应：加样见讲义。 cAMP的测定：加样见讲义。 结果处理： 1．计算各双复管cpm均值，包括Cx、CO、B、CT。 2．计算Cx－B，CO－B的值。 3．计算各标准品和样品管(CO－B) /(Cx－B)的值。 4．以标准品S1-S8,（CO-B）/（Cx-B）为纵坐标，cAMP浓度为横坐标作散点图，用直线回归，得到cAMP标准曲线。计算r值，a，b值。得出回归方程。 5．以此方程为标准，通过各样品管的(CO－B) /(Cx－B)值可，求出其各自的cAMP值。 6．酶活性计算：以每100ul大鼠尾状核匀浆液催化形成的cAMP的量表示AC活性。比较多巴胺和氟哌啶醇对AC的影响。 1.提问原理及概念。 2.演示仪器操作。 1.讲课:20分钟。 2.加药:1小时。 3. 4oC保育2小时。 课后思考题目 1.为什么用活性炭？为什么加BSA？ 2.测定AC还可以使用什么方法？ 3.反应体系中为什么加ATP？不加会怎么样？ 4.此实验中有那些因素可能影响你的结果，偏高？偏低？ 5如果你进一步做此实验，会如何设计？ 6.加无水乙醇3ml的作用？ 参考资料 药理教材及实验讲义。