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测定蛋白含量测定 粗蛋白测定（凯氏定氮法）： 水溶性蛋白测定：种子干燥后，研磨过60目筛，称取种子粉3.0000g，于瓷研钵中，加少量水研磨至匀浆，转入离心管中，放入50℃恒温振荡水浴中振荡提取30min，以4000r／min离心取上清液，用蒸馏水再洗残渣2次，重复以上过程，合并上清液（定溶到50mL），作为水溶性蛋白测定样品。 球蛋白测定：在沉淀中再添加10%（W/V）氯化钠，重复提取3次，上清液（定溶到50mL）即为球蛋白样品。 醇溶蛋白测定：在沉淀中再添加75%乙醇，重复提取3次，上清液（定溶到50mL）即为醇溶蛋白样品。 碱溶蛋白（谷蛋白）测定：在沉淀中再添加0.2%（W/V）氢氧化钠，重复提取3次，上清液（定溶到50mL）即为碱溶蛋白（谷蛋白）样品。 最后，上述B、C、D、E样品采用同A的方法进行测定。 微量凯氏定氮法 原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。 2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。 3. 滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。HCl＋NaOHNaCl +H2O 本法适用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量测定。 1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5．玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网 图3.4 微量凯氏蒸馏装置示意图 一、试剂 浓硫酸；30％过氧化氢溶液；氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）。催化剂：CuSO4、5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。指示剂：50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。 本指示剂的变色范围为 紫红色 灰色 绿色 标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）； 硼酸一指示剂混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1毫升左右混合指示剂） 5%三氯乙酸 二、测试样品三、器材 微量凯氏定氮仪；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）; 烧杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角烧瓶150mL（×4）；凯氏烧瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；电炉；分析天平。 操作方法 一、样品处理 二、消化凯氏烧瓶分别在每个凯氏烧瓶中加入约g硫酸钾－硫酸铜混合物，再加5 mL浓硫酸。通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 ~ 3h。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1 ~ 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入0mL容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。三、蒸馏 1. 蒸馏器的洗涤 蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏1 ~ 2分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。 2. 消化样品及空白的蒸馏 取50mL 锥形瓶数个，各加25mL 0.01M标准HCl和1 ~ 2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。 取2mL 稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。 用小量筒量取5mL