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双向电泳 姓名：玄哥 专业：动物遗传育种与繁殖 双向电泳的优越性 对未处理样本耐受性好 分辨率非常高 2D可以有效的组分收集器 蛋白在凝胶介质中受到保护 在蛋白质组学技术中应用范围最广 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白质更多 与后续分析技术兼容性好 样品制备 一般性原则 尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失 减少对蛋白质的人为修饰 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态 增加样品溶解性的手段 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或?-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦 (TBP) 进行还原。 双向电泳 第一向：等电点聚焦（IEF） 第二向：SDS聚丙酰胺凝胶电泳（SDS) 第一向：等电点聚焦（IEF） 原理：是根据蛋白质等电点的不同进行分离，蛋白质是两性分子，根据其周围环境PH可以带正电荷，负电荷或静电荷为零。等电点（PI）是蛋白质所带静电荷为零时的PH，周围PH小于其PI时，蛋白质带正电荷，大于PI时带负电荷。IEF对蛋白质处于一个PH梯度中，在电场的作用下，蛋白质将移向正极，直至到达等电点，如果蛋白质在其等电点，附近扩散，那么它将带上电荷重新移回等电点。 第二向：SDS聚丙酰胺凝胶电泳（SDS) 原理：低离子强度时，SDS主要以单体形式存在，此时它可以与蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物。当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，从而掩盖了不同蛋白质间电荷的差异，使所有蛋白质都带有相同密度的负电荷，于是蛋白质间不存在电荷密度的差别。而SDS蛋白质复合物都是椭圆棒形，无形状差别，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS中蛋白质仅存在分子大小的差别，于是可利用分子量差异将各种蛋白质分开（分子筛效应）因此SDS正常用于测定蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。 2D问题与原因 —— 染色的问题 出现垂直条纹 上样量过大或某种蛋白的表达量太高会产生纵向拖尾;第二向电泳的电极缓冲液的pH值配制不正确或电极缓冲液中SDS过少(建议含量为0.1%)会引起胶上蛋白点拖尾硝酸银染色时间过长,同时伴有凝胶背景底色过黑。 其他问题 出现空白垂直条纹空白垂直条纹 背景色不均匀 蛋白斑点扭曲 配制Tris-HCl(pH8.8)缓冲液的实际pH值过高会导致电泳时间过长,出现低分子量蛋白流失,造成实验结果信息的丢失;相反,则电泳时间过短,溴酚蓝已到达终点,而蛋白仍未完全分开 蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程 结束 谢谢 * * * * * * * * 由于基因表达水平与蛋白质水平之间并不完全相关，我们仍然得不到完整的信息.其解决办法之一是直接研究基因的产物——蛋白质 1994年Wilkin和Williams提出蛋白质组这一概念后，蛋白质组在生物学界得到了充分关注，而蛋白质组的开门技术— — —双向电泳，双向电泳由O^Farrell于1975年首次建立的。 MALDI-TOF质谱分析 自动点靶 自动酶解 自动切点 蛋白质组学完整平台 全自动软件分析 图像采集 双向电泳 样品制备 蛋白质净化 双向电泳 样品制备 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （＋） （＋） （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH 双向电泳（2DE）示意图 提取的总蛋白溶液 等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离 SDS分离，使得蛋白质按分子量大小排序 分子量 大 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离 蛋白检测 硝酸银染色 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差，质谱兼容性低 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等 上海博苑生物科技有限公司 SYPRO Ruby 蛋白染色 (荧光) Bio-Safe? 考马斯蓝染 (可见光) 银染 (可