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九龙江水大肠杆菌的测定 （漳州师范学院生物系食品科学与工程09级 091304203 曾萍萍） 摘要：通过对九龙江水中的大肠杆菌群数的测定，可检验九龙江水的受污染程度。可以通过多管发酵法和革兰氏染色等方法测定大肠杆菌群数。依据大肠杆菌群在37生长时使乳糖发酵而产酸产气，其在培养基上形成有金属光泽的紫黑色菌落。查大肠杆菌检数表，就可以了解水的受污染程度。 关键词：大肠菌群 多管发酵 革兰氏染色 产酸产气 实验材料和设备： 试管、吸头（1ml、5ml）、冰箱、量筒、玻棒、烧杯、PH计、培养皿、水浴锅（箱）、培养箱、试剂瓶、电磁炉、显微镜、锥形瓶、接种环、干燥箱、汉德氏管、高压灭菌器、单道移液器、电子分析天平 培养基：乳糖胆盐蛋白胨 ， 伊红美蓝琼脂（EMB） 操作步骤 （一）多管发酵（大肠菌群的测定） 1、水样的采集： 用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。 2、水样的稀释： 将灭菌的三根试管各装9ml的无菌水标上1、2、3的记号。充分振荡水样，从中吸取1ml于1号试管中，充分振荡即得1：1 0的稀释 液。同理配制1：100及1：1000稀释液。 3、水源水的检查 （1）初步发酵试验 在1个含有50ml 三倍浓缩的乳糖胆盐蛋白胨发酵烧瓶中，加入100ml 水样（轻度污染水的测定）。 在1支含有5ml 三倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，各加入10ml 水样（中、轻度污染水的测定各一支）。 2）从原水样、1:10、1:100、的稀释液各吸取1ml于4支经过灭菌的装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨中。（每吸取一次，吸头都要换一次。）原水样，1:10重复一次（中、轻度污染水的测定各一支）。 （3）将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h，24h未产气的继续培养至48h。记录其稀释液的产气管数，进行复发酵试验。 （4）平板分离 经24h 培养后，将产酸产气及48h 产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18-24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 （5）复发酵试验 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。 2革兰氏染色法 2.2.1实验器材 （1）菌种 （2）染色剂：革兰氏染色液 （3）仪器及其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶、擦镜纸、生理盐水等 1. 制片 (1)涂片:取干净载玻片一块,在载玻片中间加一滴蒸馏水,按无菌操作法取菌涂片,制成很薄的涂 面,注意取菌不要太多. (2)晾干:让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干. (3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰 2-3 次固定(以不烫手为宜) 注意: 要用活跃生产期的幼培养物做革兰氏染色; 涂片用的载玻片要洁净无油污迹,否则影响涂片. 挑菌量应少些,涂片宜薄,过厚重叠的菌体则不易观察清楚. 2. 初染 (1)结晶紫色染色:将玻片置于干净的培养皿上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色 1-2 分钟. (2)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗. 3. 媒染 (1)用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约 1 分钟. (2)水洗:用水洗去碘液. 4.脱色 用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加 95%的乙醇脱色,直至流出的乙 醇无紫色时,立即水洗. 革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度,革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏 阴性细菌.而脱色时间过短,革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌.脱色时间的长短还受涂 片的厚薄,脱色时玻片晃动的程度等因素的影响.脱色时间一般约 20-30s. 5. 复染 (1)用番红复染约 2 分钟. (2)水洗:用水洗去涂片上的番红染色液. (3)晾干:将染好的涂片用吸水纸吸干. 6.镜检 镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性.被染成蓝紫色的 是革兰氏阳性菌,被染成红色的是革兰氏阴性菌. 附录： 1.乳糖胆盐蛋白胨液体培养基 乳糖 10g 蛋白胨 20g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL 胆盐 5g 蒸馏水 1000mL 将上述培养基成分加热