10-AKP活性检测27日.pptVIP

QA 关于噬菌体污染 表达产物AKP蛋白的检测 1. 菌体加入15mL匀浆液 2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次 3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 4. 匀浆上清制备：另取1.0 mL细胞破碎液，4℃, 12000rpm×10min离心，留上清液 5. 上清液制样：匀浆上清 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ，90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 SDS的 浓 缩 效 应 电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成 电荷效应：Cl－的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动Pr－和Gly－快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr－浓缩成狭小薄层 SDS的变性作用 SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开 ∴ 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物 由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷 SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 ∴ SDS中，SDS－蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关-分子筛效应 * 处理：1、环境用漂白粉灭菌； 2、用消毒液浸泡相关器具；3、菌种室甲醛熏消一夜；4、福尔马林溶液浸泡； 5、更换或交替使用发酵剂；6、采用抗性菌株； 特征：1、培养液变澄清；2、养份没有被正常消耗； 3、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑； 污染原因：菌体自带噬菌体 (特别是溶源性细菌);  环境中存在； 基因的克隆与表达专题之八 AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下:水解多种磷酸单酯化合物 需要镁和锰离子为激活剂 关于AKP (E.coli alkaline phosphatase） 6.2S 沉降系数(二聚体) 9.6S 沉降系数(四聚体) 3.4cm3/g 固有粘度 3.3×10-5cm2/V sec at pH7.6 电泳迁移率 pH 4.5 等电点 pH 6.3 等离子点 1.05 摩擦比率 (67-98)×103 at pH8.0 MWw (88-99)×103 at pH8.0 MWz (86-110)×103 at pH8.0 MWZ+1 0.72 吸光率(278nm for 1mg/ml) Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+ 激活剂 氰化物, 焦磷酸盐 抑制剂 85℃加热30分钟仍保留活性，Mg2+存在时可增加酶的热稳定性 热稳定性 6.0 at pH8.0 沉降系数(单体) AKP的理化性质 蛋白检测指标 1、质 活 性 分子量 定 性 结 构 2、量 表达产率 获得产量 蛋白浓度 纯 度 根据蛋白的特性 Western，测序等 电泳，分子筛，沉降系数等 光/色谱，晶体衍射等 分光， 凯氏定氮等 电泳，沉降、晶体衍射等 1、酶活测定：底物显色法 AKP 405nm有特征吸收 本实验410nm测定OD值 pNPP（对硝基酚磷酸） 无色 ＋Pi pNP （对硝基酚） 黄色 Na3PO4 比尔-朗伯定律：ODλ = ?LC εpNP=17500L ·mol-1 · cm-1 C:光吸收物质的浓度（mol·L-1） L:光路长度（cm） 1、酶活测定：底物显色法 （其中n为稀释倍数） 酶活力单位数＝ 注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.1～0.8之间 30℃反应10min 加入3.6ml终止液终止反应 于410nm处测定吸光值 40μL酶液 360μL测活液 + 实验操作 一、细胞破碎与制样 OD410 40 0 40 0 0 0 离心上清（uL） AKP表达 pETBlue-AKP阳性对照 空载体表达阴性对照(蓝斑) 空白零对照 组别 3.6 360 40 0 3.6 360 40 0 粗匀浆 3.6 360 0 0 上清 酶的活力 3.6 3.6 3.6 终止液（mL） 室温反应10min 360 360 360 测活液（uL） 0 40 0 粗匀浆（uL） 0 0 40 匀浆液（uL） 上清 粗匀浆 二、AKP酶活性分析 自然胶电泳； 变性胶电泳