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含半胱氨酸或胱氨酸的多肽的氨基酸组成分析 喻宏伟① 廖海明② 何吕兴③ 杨定忠③ 卢娟娟① 车晓利① 齐振兴① （1 北京普析通用仪器有限责任公司 2 中国药品生物制品检定所 3 北京艾杰尔科技有限公司） 摘要：使用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生剂，并在衍生过程中加入二巯基二丙酸(MPA)保护半胱 氨酸。同时采用反向高效液相色谱法，以正亮氨酸为内标物，使用普析通用L6-2 型高效液相色谱仪 及Venusil-AA 氨基酸分析方法包，分析多肽样品生长抑制素和鲑鱼降钙素中氨基酸组成。测得各氨 基酸含量与理论值偏差在-15%至10%之间。本方法快速、灵敏、准确，特别适用于同时含有胱氨酸 和半胱氨酸的多肽氨基酸组成的测定。 氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生 物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究 抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定 食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。 氨基酸分析技术始于20世纪三、四十年代，1958年，Moore和Stein首先将离子交换树脂用于氨 基酸分析中．研制出了世界上第一台用离子交换树脂和柱后茚三酮衍生检测法的自动氨基酸分析仪 [1] 。经过40多年的发展，氨基酸分析方法得到不断的改进和完善，逐渐发展为多种分析方法并存的 局面。这些方法可以归纳为两类：一、衍生化间接分析法，包括衍牛化离子交换色谱法、衍生化高 效液相色谱法、衍生化气相色谱法和衔生化毛细管电泳法；二、无需衍生化的直接分析法，主要指 高效阴离子交换色谱一积分脉冲安培法(HPAEC—IPAD)[2] 。 柱前衍生化高效液相色谱法分析氮基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点， [2] 已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用 。柱前衍生化高效液相色谱法一般采用 C18键合硅胶为固定相、极性溶剂／弱酸盐缓冲液为流动相。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)[3]、 萘-2,3-二甲醛(NDA) [4]、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC) [5]、异硫氰酸苯酯(PITC) [6]、丹酰氯(Dansyl-C1) [7]、4,4’-二甲胺基偶氮苯-4’-磺酰氯(DABS—C1) [8]、6-氨基奎啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐(AQC) [9] 和2,4一二硝基氟苯(DNFB) [10]等。 其中PITC衍生试剂可同时测定伯氦酸和仲氦酸，衍生副产物对测定无干扰，衍牛物非常稳定(在 干燥条件下可在冰箱中长期储存) ；缺点是流动相中的杂质和含硫氨基酸(半胱氨酸和高半胱氨酸)形 成的二硫化合物会干扰亮氮酸的测定，不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸[11] 。本实验采用二巯基二丙 酸（MPA ）为保护剂，保护分析中容易发生转化的半胱氨酸，使得PITC法也能同时测试胱氨酸与半 胱氨酸的含量，拓展了PITC法测定氨基酸的适用范围。 1 材料与方法 生长抑素和鲑鱼降钙素样品由中国药品生物制品检定所提供。氨基酸标准样品，三乙胺和PITC 衍生剂由北京艾杰尔科技有限公司提供。乙腈（色谱纯）为Fisher 公司产品，其他为市购分析纯样 品。 高效液相色谱系统采用北京普析通用公司L6-2 系列高效液相色谱仪，包括L6-DP6 二元高压输 液泵，L6-UV6 可变波长紫外检测器以，L6-CO1 色谱柱温箱，L6-AS6 自动进样器。分析色谱柱为 VenusilAA 氨基酸分析柱（5μm,4.6 ×250mm ），购自北京艾杰尔科技有限公司。 1.1 样品水解和衍生 1. 供试品溶液的配置 称取生长抑素 11.6mg ，加水至 1ml ，作为生长抑素供试品溶液 称取鲑鱼降钙素 9.3mg ，加水至 1ml ，作为鲑鱼降钙素供试品溶液。 2. 氨基酸标准溶液的配置 氨基酸标准溶液采取Agela公司提供氨基酸方法包中的标准溶液，其中含有天门冬氨酸（Asp ）、 谷氨酸（Glu ）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly ）、组氨酸（His ）、精氨酸（Arg ）、苏氨酸（T