携带人livin α基因腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达.pdfVIP

6 · 493 doi：10．3969／j．issn．1000-484X．2012．06．003 携带人 livin 基因腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达① 谢军平 李环羽 高 亭 王石生 颜春松 况九龙 (南昌大学第二附属医院呼吸内科，南昌330006) 中国图书分类号 R392．11 文献标识码 A 文章编号 1000484X(2012)06-0493-05 [摘 要] 目的：本研究旨在利用AdMax系统构建携带人抗凋亡基因livin0【的重组腺病毒载体 (rAd—livin仪)，并感染树 突状细胞(Dendriticcells，DCs)，制成DCs疫苗，为下一步用此疫苗抗肿瘤实验奠定基础。方法：以质粒 plRES2一EGFP—livin 为模板 ，通过 PCR扩增出人 livin 基因cDNA序列 ，再将 livin0l基因cDNA亚克隆于穿梭质粒pDC316一EGFP—cmv，获得重组 质粒pDC316·EGFP—cmv—livinoL。将鉴定后的重组穿梭质粒pDC316一EGFPcmv—livinot与腺病毒辅助质粒 pBHGlox(delta)E1， 3Cre共转染HEK293细胞，同源重组获得重组腺病毒rAd-livinot。用重组腺病毒 rAd．1ivin仪感染人 DCs后，Westernblot方法 分析 livin仪蛋白表达，流式细胞仪检测 DCs的表型变化。结果：在 HEK293细胞内能观察到重组腺病毒rAd—livinot绿色荧光 蛋白的表达。rAd-livin0【经PCR鉴定特异性地扩增出符合预期大小的片段。rAd．1ivin 感染的DCs中可检测到 livind蛋白 的表达，并且感染的DCs与未感染 DCs比较 ，可明显提高了细胞表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达 (P0．05)。结论： 通过 AdMax系统成功构建了重组腺病毒rAd—livinot，使 livind蛋白有效表达于DCs中，并且重组腺病毒感染的DCs的成熟度 得到提高。 [关键词] 基因转移；livino．／；重组腺病毒；增强的绿色荧光蛋白；树突状细胞 Constructi0n 0farecombinantadenoviralvectorencodingfunctionalhumanlivin 仅 geneand itsexpression indendriticcells XIEJun—P ，LIHuan—Yu，GAO ，WANGShi—Sheng，YANChun—Song，KUANG 一 ．DepartmentofR唧 ratoryDisease，SecondAffiliatedHospital，NanchangUniversity，Nanchang330006，China [Abstract] Objective：Toconstructtherecombinantadenovimsvectorcarryinghumanantiapoptosisgenelivin (rAd—livin0)【 byAdMaxsystemandmakevaccineusingtherAd—livin0ltoinfectdendriticcells(DCs)．Thiswillprovideexperimentalbasisfornext antitumorresearchesusingthevaccine．M ethods：Thefull—lengthcDNA ofhumanlivinotwasamplificatedfrom theplasmidpIRES2一 EGFP．1ivinotandwassubclonedintotheadenovirusshuttleplasmidpDC316一EGFP．emv．ThenewlyconsturctedplasmidpDC316一EG— FP—cmv—livinor．transfectedintoHEK293，togetherwiththehelperplasmidpBHGlox(delta)E1，3Cre．Basedonthehomologousrecom— binationofthetwoplasmidswithinHEK293cells．rAd—livindwasgenerated．ThenhumanDCsweretransdu