利用转座子标签法构建埃氏巨型球菌乙酸生成关键酶基因.pdfVIP

利用转座子标签法构建埃氏巨型球菌乙酸生成关键酶基因 缺失工程菌 1，2 1 1 1 1* 刘国文 ,崔晓霞 ,逄晓阳 ,杨文艳 ，王哲 （1、吉林大学农学部畜牧兽医学院，吉林 长春 130062；2、内蒙古民族大学动物科技学院， 内蒙古 通 辽 028042；） 摘要：应用转座子标签法，通过转座子供体菌E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌埃氏巨型球菌进行转座 子诱变，采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子，共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具 有抗性的转座工程菌9株。对埃氏巨型球菌的突变株进行 16S rRNA和Tn5的PCR鉴定，及乙酸激酶（AK） 和磷酸转乙酰酶（PTA）酶比活力分析，确定突变株属于 pta 基因缺失型氟乙酸抗性菌株。 关键词：埃氏巨型球菌 转座子 氟乙酸 磷酸转乙酰酶 乙酸激酶 埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii ）是奶牛瘤胃内一种常见的革兰氏阴性乳酸发酵菌， 它能发酵很多种不同的可溶性碳水化合物，利用丙烯酸途径将乳酸分解为丙酸，或者经乙酰 辅酶A途径在乙酸激酶（AK）和磷酸转乙酰酶（PTA）的作用下生成乙酸[1]。奶牛在妊娠后期 和泌乳初期及疾病状态下，瘤胃内发酵菌的数量和比例发生改变，使丙酸生成减少，而乙酸 生成增加[2] 。恢复和重建瘤胃微生物区系，不仅可增强围产期奶牛的消化功能，增加采食量， 还可提高生糖先质丙酸的生成量，纠正或缓解围产期奶牛能量负平衡。从细菌的代谢途径分 析, AK－PTA途径是菌体产生乙酸的主要途径[3] 。运用转座子标签法，通过切断细胞代谢网 络上产生乙酸的途径，来调整代谢过程中碳源的流向，达到增加丙酸产量或比例的目的。本 研究采用转座子标签法，以健康奶牛瘤胃中分离的埃氏巨型球菌为受体菌，以大肠杆菌 E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5作为供体菌进行转座子Tn5诱变,通过选择性平板，筛选转结合子 中ack或pta基因缺失的菌株，构建乙酸生成关键酶基因缺失工程菌。 1 材料与方法 1.1 供试菌株 受体菌埃氏巨型球菌 H6 本课题组从健康奶牛瘤胃中分离。供体菌 E.coli S17-1/pZJ25∷Tn5 由南京农业大学王金生教授惠赠。 1.2 工具酶与生化试剂 Ex Taq 聚合酶 （5U/μL），DNA Marker，dNTPs（2.5mM）均购自TaKaRa 公司；DNA 回收纯化试剂盒购于杭州维特洁生物技术公司；SDS、Tris、夹竹桃霉素、氯化 血红素、维生素 K 等购自 Sigma 公司，蛋白胨、酵母提取物购自 Oxoid 公司。 1.3 各种培养基的配制 ①VS厌氧血琼脂（100mL）：胰蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0.3 g，硫 乙醇酸钠 0.075g，吐温-80 0.1g，0.1%煌绿 0.1mL，50%乳酸钠 2.5mL，琼脂 2.0g，蒸馏水 93mL高压灭菌（121℃ 20min），冷却至 40℃时加入 1%夹竹桃霉素 0.3mL和脱纤维羊血 7.5mL，而后铺平板。②埃氏巨型球菌营养液：酵母提取物 4.0g，乳酸钠（60%）16mL，硫 乙醇酸钠 0.45g，KHPO 1.6g，KHPO 3.2g，NH Cl 0.5g，CaCl 0.2g，MgCl 0.2g，琼脂 1.0g， 2 4 2 4 4 2 2 加蒸馏水至 1000mL，调pH值至 7.0，在N2下分装，121℃高压灭菌15min，而后冷却后放入 4 ℃冰箱备用。 9 1.4 受体菌对卡那霉素、氟乙酸钠不同浓度敏感性的测定 用微量加样器吸取 10 cell/mL的 基金项目：国家自然科学基金重点资助项目） 作者简介：刘国文（1973-），男，副教授，在站博士后，主要从事动物营养代谢病的研究。 *通讯作者