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RNAi技术与应用中的相关同位素示踪技术 齐孟文 中国农业大学 RNAi(RNA interference)是指一种分子生物学上由外源双链RNA诱发的基因 沉默现象，当向细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，其会降解或 抑制mRNA而导致基因表达沉默，产生相应的功能表型缺失, 这一过程属于转录后 基因沉默机制。RNAi 广泛存在于自然生物界，被认为是生物防御外源基因和病 毒入侵的一种防御机制，同时在基因表达调控中具有重要作用，如真核生物30% 的基因，由RAN非编码区高度保守的内原小分子microRNA（miRAN）组成，并在转 录后及翻译水平调控基因表达。RNAi是整体功能基因组研究的一种强有力的工 具，通过向细胞导入dsRNA，选择性地使特定基因沉默, 进而通过功能表型缺失 逆向研究该基因的功能，同时RNAi在依赖RNA的药物筛选及其治疗中广阔的应用 前景，而同位素相关示踪技术，是 dsRNA的细胞导入、定位及效能等过程的一种 强有力的分析及可视化手段。 1. RNAi技术 1.1RNAi的原理 RNAi及其作用途径主要有3类,即：短干扰RNA（short inference RNA,SiRNA）, 引起RNAi反应的是长度为 19-21 个核苷酸的短双链RNA分子，5’被磷酸化，3’ 有 2 个突出的核苷酸,由所属RNaseⅢ家族的核糖核酸内切酶Dicer,以一种ATP依 赖的过程，逐步切割外源长双链RNA分子形成；微RNA（microRNAs，miRNA）,是 在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA，其大小长约 20∼25 个核苷 酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶剪切加工而产生的， 随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根 据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译；piRNA (Piwi-interacting RNA) 是从哺乳动物睾丸组织中发现的一类能与PIWI 蛋白 质相互作用，且长度为26～31 核苷酸的新型小分子单链RNA,其RNAi的作用机制 尚不十分清楚，推测在果蝇中的作用模式如图所示。 RNA介导的基因沉默的共同特点是，负责沉默作用的称为向导链RNA与 Argonaute家族蛋白发生相互作用, 通过碱基互补配对原则，引导Argonaute蛋白 识别序列特异性靶标mRNA并与之结合，之后切割降解或者抑制mRNA翻译。 Argonaute有各种亚科，以识别各种不同小RNA分子，表现为不同的沉默途径， siRNA和miRNA都能与其亚科蛋白AGO蛋白结合，但是piRNA与亚科蛋白PIWI蛋白结 合。由siRNA介导的RNAi途径中，Argonaute利用其内切核酸酶活性来切割mRNA 靶分子，而在piRNA介导的RNA沉默途径中，利用的也是切割机制，切割位点对应 向导链5’端开始第10和第11位碱基处磷酸基团处, 要求向导链和靶标链在切 割位点处互补。Argonaute蛋白可以通过抑制目的mRNA翻译的办法，以及诱导目 的mRNA发生脱腺苷化作用（deadenylation）后降解的方法来达到基因沉默的作 用。 Argonaute 是一类多结构域蛋白，其含有 N 末端结构域、PAZ 结构域、MID 结构域和 PIWI 结构域，PIWI 结构域具有 RNaseH 式样的折叠情况，RNaseH 酶一 般需要二价金属离子子的辅助来完成切割反应，在极端嗜热菌 Argonaute 蛋白 Ago的晶体结构中也发现了与镁离子结合的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸基序，这 正是 RNaseH 酶的活性位点。在 siRNA 和 miRNA 分子掺入 RISC 复合体时，有一 RNA 分子的末端识别过程，PAZ 结构域具有将 RNA 向导链的 3’端铆定的作用， 某些情况下发现RNA分子3’端突出的碱基，插入其由保守的芳香族氨基酸残基 形成的疏水口袋。在 siRNA 和 miRNA 介导的基因沉默途径，RISC 复合体装载过 程中，Argonaute 蛋白必须要能够在与 siRNA 双链或 miRNA-miRNA*双链分子结 合时准确识别 RNA 向导链并与之结合，剔除掉没有功能的随从链和 miRNA*链， 然后依照向导链的指引发现目的 RNA，向导链一般是 5’端的热稳定性较差的那 条链，根据对结合