NO18绿色木霉的原生质体制备与转化条件.pdfVIP

维普资讯 农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBioteclmology 2004，12 (1)： 96~101 · 研究论文 · 绿色木霉的原生质体制备与转化条件 刘士旺 王政逸 郭泽建 料 (1．浙江大学生物技术研究所，杭州310029；2．中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100094) 摘要：对绿色木霉(Trichodcrmaviride)原生质体制备和再生的条件进行了较详细的分析，并在此基础上进行了木霉的转 化。结果表明，木霉原生质体形成的合适条件为：培养24h的菌丝用4mg／mL的Glucanex在磷酸盐缓冲液中(pH6．98)、3O ℃、振荡 (40r／min)酶解4h，原生质体产量达到4．7×lO个 ／mg。原生质体在O．3molL／肌醇和O．3moFLKC1的CM 培养基上 再生率为 14．5％。对绿色木霉原生质体的激发子基因转化，其转化率为每微克DNA得到 l~2个转化子。转化子的PCR鉴定以 及激发子抗体的特异酶联免疫测定 (ELISA)结果，表明外源基因已转入绿色木霉并有稳定产物表达。 ‘ 关键词 ：绿色木霉；原生质体；转化 IsolationandTransformationofTrichodermavirideProtoplasts LIUShi—W ang WANGZheng—Yi GUOZe—Jian (1．BioteclmologyInstitute，ZhejiangUniversity,Hangzhou310029，China；2．CollegeofAgronomyandBiotcclmology,China AgriculturalUniversiyt，Beijing100094，China) ’ ^b■髓陡 Theconditionsforprotoplastisolationnadregenerationfrom Trichodermavindewerestudide． Theoptimm conditionsforprotoplastioslationwerethe24一hours-culturedhyphaof vindedigestde wiht4mg／mLGlucanexnIphosphatebuffer (pH6．98)ofr4hat30qc，hteyieldofhteprotoplastswas4．7x10cof／mg．Themaximumregenerationrate(14．5％1wasobtainde in hteCM medimu containing0．3mol／L KCIna d0．3mol／Linosito1．Further,plasmidpCSSNCC1carryingahygromycniresistantgone nadna elicitorproductiongeneWas transformde intohteprotoplastsof vinde, wiht na efficiencyof1—2transformantsper microgramofDNA．Thehygromycin(Hyg)-resistanttransformnatswreedetermindebypolymerasechainreactions(PCR)nadhte elicitorproteniWasdeterminedbyenzymelinkedimmunosorbnatassay (ELISA)．TheresultindicatedthathteelicitorproteniWas expressde satblyin vinde． K _DldI：Trichodermaviride；protoplast；transformation 绿色木霉是一类普遍存在的丝状真菌。木霉具 菌在具有