高温DNA聚合酶的选择.pdfVIP

DNA DNA 高温DDNNAA聚合酶的选择 耐高温DNA聚合酶的选择对于实验目的、实验的准确性、稳 定性等均是成败攸关。从扩增的速率和忠实性来考虑, 耐高温DNA 聚合酶可分为三类： 第一类：扩增效率高,但没有校正功能。该类聚合酶具有很强的 从5’→3’方向合成DNA功能，但没有从3’→5’方向外切酶的活性。该 类酶的合成效率高，但合成过程中出现的错误不能被有效纠正，我们 的实验数据表明，在80%的克隆中，每一个kb可能会产生1～2突变。 该类酶的代表就是普通Taq 酶（TaqDNAPolymerase），它扩增效率 高，广泛应用于DNA片段大小的鉴定和菌落克隆鉴定，由于该酶尚 能在合成的DNA的3’端羟基上加A，故而还用于PCR产物的T载体 克隆。因该类酶不具有纠错功能，因而其扩增产物不宜用于基因突变 检测和以基因表达及功能研究为目的之基因克隆。市售的所谓 PlatinumTaq 据称有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但笔者在 美国做博士后研究期间用它来做批量克隆，测序结果发现其突变频率 与普通Taq酶没有多少差别，对其印象深刻，因而它应被归类为普通 Taq酶类。 第二类：既具有5’→3’方向合成DNA的功能，又具有3’→5’方 向外切酶的活性和纠错功能，但DNA合成效率与普通Taq 酶相比大 大降低。PfuDNA 聚合酶便是这一类酶的代表，据称，Pfu的保真度 在所有耐热DNA聚合酶中是最高的。我们以Pfu作为批量克隆中的 工具酶，测序结果表明，0.8～1.5kb 的扩增片段，50%的克隆发现有 突变；而1.8kb以上的扩增片段克隆中，突变的发生几乎无一幸免。 第三类：兼有第一类和第二类酶的优点。从形式上看，将普通Taq 酶与PfuDNA 聚合酶按一定比例混合即可（如Taq Plus,LATaq,Ex Taq），并为很多公司和研究者所采用，但混合后由于二者对底物模板 存在竞争性以及酶促反应动力学的紊乱而影响最终效果，于是，用基 因工程的方法获得理想的第三类酶便成为PCR领域的一块研发高地。 XXX公司科研人员，利用丙氨酸扫描技术鉴定出聚合酶和外切酶活 性的最小结构域和相关的活性位点，进而用遗传学和基因工程方法获 得既能高效扩增又具有很强的校正功能的金牌Taq （FGGoldenTaq DNAPolymerase），稳定性高于普通Taq酶，纠错功能强于Pfu。 （LA的扩增效率还是可以的，但突变率确实很高，就看你的目的是什么，如果是用来做克 隆表达，那就千万不要选LAtaq.LATaq是在做PCR时候扩增长片段DNA所用的酶,LA代 表long和accurate，lataq 对gc含量较高的引物有较好的扩增效果） *********************************************************** LATaqDNA 聚合酶是一种具有5-3’DNA聚合酶活性和3-5校对活性的聚合酶，可用 于扩增较长的富含 GC的片段。作为具有3-5校对活性的且热稳定性最强的DNA聚合酶之 一，该酶可在最佳温度（75°C）催化 DNA合成，且错配率低（准确率约是标准Taq DNA 聚合酶的10倍）。该酶可扩增人基因组DNA长达 15Kb 的片段和λDNA长达20Kb 的片段。 在较长的PCR 扩增中应用LATaqDNA 聚合酶可减少拖尾效应，实际上减少背景影响。LA TaqDNA 聚合酶扩增产物带有A尾可用于T-A克隆。 组分与保存条件 数量 保存 组分名称 LA TaqDNA 聚合酶(5 U/μl) 25/50 μl -20℃ 2×HG PCR Buffer 1 1.25 ml/x2 -20℃ 活性定义 一个活力单位即以活性化的大马哈鱼精子 作为模板 引物，在 ° 、 分钟内，摄入 的全核苷酸为酸性不溶物质所需的酶量。 DNA