第14章基因重组.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering DNA作为遗传物质,具有保守性﹑变异性和流动性。自然界DNA重组和基因转移是经常发生的,它是基因变异﹑物种演变﹑生物进化的基础。 DNA重组类型 . Holliday模型的4个关键步骤： １两个同源染色体DNA排列整齐； 参与E.coli同源重组的酶 recA蛋白：可结合单链DNA ，插入双链DNA同源区，与互补链配对，将同源链置换出来。 recBCD：有三种酶活性，依赖于ATP的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶。 ruvC：内切酶，可切开同源重组的中间体。 质粒：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。 只有某些较大的质粒如 F 因子(F factor) 方可通过接合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 细菌F 因子含编码性鞭毛蛋白的基因(F+细胞)，决定细菌表面性鞭毛的形成。 当含F 因子的细菌与不含F 因子的细菌相遇时,性鞭毛连接就会在两细菌间形成,质粒双链DNA中一条会被酶切割,产生单链缺口DNA,单链DNA转移到F﹣细菌，为模板链。 两细菌以单链DNA为模板,合成互补链。 λ噬菌体的生活史：感染宿主时有二种结果 溶菌生长途径 (lysis pathway)：感染宿主，产生新病毒，并溶解细菌，释放新λ噬菌体。 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) ：λ噬菌体DNA整合宿主DNA，随宿主DNA复制而复制，经过一定时间，进入溶菌途径 。新λ噬菌体DNA从宿主DNA中切割下来时，含有部分宿主DNA。 λ噬菌体感染新宿主，前宿主细胞DNA转移到新宿主细胞，发生转导作用 沙门菌的H1和H2鞭毛蛋白分别由两个基因编码， H2基因和rH1基因协同表达； rH1基因产生阻遏蛋白，使H1基因关闭。 表达H1鞭毛蛋白即Ⅰ相，表达H2鞭毛蛋白即Ⅱ相。处于Ⅰ相或Ⅱ相细菌在细胞分裂时，以1/1000的频率产生另一相的后代，即鞭毛相变。 hin基因编码特异的重组酶，即倒位酶Hin。 免疫球蛋白研究发现，它能千变万化地、特异地与各种各样的相应抗原结合。 Ig多样性如何在基因分子水平上解释？ 免疫球蛋白基因发生重组，形成具有不同抗原特异性的抗体基因。 重链基因的V-D-J重排和轻链基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。 重组信号序列(RSS)由一个共同的七核苷酸序列(CACAGTG)和一个共同的富含Ａ的九核苷酸序列(ACAAAAACC)，中间为固定长度的间隔序列组成。 此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 RAG1识别九核苷酸序列提供的识别位点，七核苷酸序列为切割位点。 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 分类： 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ三类。 Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶， 切割的靶位点对DNA的序列要求严格，切割精确。 被誉为分子生物学家的手术刀。 作用：多种细菌能合成限制性核酸内切酶，这是保护它们自己，降解外来DNA分子的重要手段。 细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键; 同时细菌中又伴随存在甲基化酶,能使细胞自身相应序列上的碱基甲基化,从而避免受内切酶水解。 而外源DNA一旦进入细胞立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。 这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA, 限制外来的DNA, 这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。 从微生物中发现分离得到的限制性核酸内切酶是重组DNA技术中很重要的工具酶。现在已供商品应用的限制性核酸内切酶有几百种， Ⅱ类限制性核酸内切酶的作用特点 1、有严格的识别、切割的DNA序列，且就在识别位点范围内切断DNA。以内切的方式水解双链DNA分子中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。 2、识别序列一般为4～6个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成180°反向重复(inverted repeat)。这种结构也称为回文结构(palindrom) 3、切割后产生平头或粘性末端。 大多数酶是错位切割双链DNA， 产生5’ 或3’粘性末端；一些酶沿对称轴切断DNA，产生平头末端。 4. Ⅱ型酶切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DN