产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌分离.docVIP

实验一 产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm0.6×1～1.5 μm，H2S，VP反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃：100 mL/组，其中20 mL/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min 200 mL/500 mL△×1（10个平板）组分 配方要求(%) 母液浓度(%) 各成分的取量（mL）/200ml KH2PO4 0.036 3.6 2 MgSO4·7H2O 0.05 5 2 ZnCl2 0.0014 0.14 2 Na2HPO4·7H2O 0.107 10.7 2 NaCl 0.016 1.6 2 CaCl2 0.0002 0.02 2 FeSO4 0.0002 0.02 2 *酪素 0.4 4 20 Trypticase 0.005 0.5 2 琼脂 2.0 * 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。 pH 6.5～7.0121℃，灭菌20min：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支 1.采样 学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。 2. 增殖培取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min以杀死样品中的微生物营养体细胞。然后30℃150 r/min，振荡培养24h。取样镜检形成芽孢的情况。 将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。 然后取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。 1．掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 2．掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 λ/dλ噬菌体的大肠杆菌，称为双重溶源性菌株。该菌株同时被λ完整噬菌体和λ缺陷噬菌体(dλ)侵染。该菌株一般用于高频转导，两种噬菌体中只有完整的λ噬菌体才能在侵染敏感株后于固体平板上形成噬菌斑。每毫升噬菌体裂解液中所含的噬菌体数量被称为噬菌体效价，一般以每毫升噬菌体裂解液在含有敏感菌的固体平板上形成的噬菌斑的数量来表示。裂解量则是表示一个细胞被裂解后所释放出的噬菌体数量，可以根据每毫升裂解的溶源性菌株数量和效价进行计算。 三、实验材料 1. 菌种：带有噬菌体λ和缺陷噬菌体(λdgal+)的双重溶源菌(E.coli K12F2gal-/λdgal+/λ) 敏感菌 大肠杆菌(E.coli K12Sgal-) 2.