奈瑟氏淋球菌表面蛋白基因克隆及在真核细胞中的表达研究.pdfVIP

44 卷 　1 期 微 生 物 学 报 Vol. 44 No. 1 2004 年 2 月 Acta Microbiologica Sinica February 　2004 奈瑟氏淋球菌表面蛋白 A 基因克隆及 在真核细胞中的表达研究 季明春 　陈红菊 (扬州大学医学院微生物学和免疫学教研室　扬州　225001) 摘 　要 :为了研制奈瑟氏淋球菌外膜蛋白 —奈瑟菌表面蛋白 A ( Neisseria surface Protein A ,NspA) 的核酸疫苗 ,根据淋 球菌 NspA 的基因序列 ,设计一对寡核苷酸引物。以淋球菌 WHOA 菌株基因组 DNA 为模板 ,通过 PCR 扩增获得具 ( ) 有完整开放读码框架 ORF 的 NspA 基因 ,并将其正向插入真核表达载体 pCMVscript ,成功构建了表达 NspA 基因的 真核细胞表达载体pcNspA 。用脂质体包裹pcNspA 重组质粒转染 COS 细胞 , 以间接免疫荧光分析法分析 NspA 基因 的表达 ,发现转染pcNspA 的 COS 细胞能高表达 NspA 抗原。淋球菌免疫保护性抗原 NspA 基因的克隆与真核细胞 表达 ,为进一步研究淋球菌 NspA 对雌激素处理的淋球菌感染实验小鼠的免疫保护作用奠定了基础。 关键词 :奈瑟氏淋球菌 , 表面蛋白 A , 克隆 , 表达 中图分类号:Q933 　　文献标识码 :A 　　文章编号 (2004) 　　奈瑟氏淋球菌在漫长的进化过程中已经形成一套逃避 CATGAAAAAAGCACTTGCC3′, 引 物 2 : 5′GGGCTCGAGT 人体免疫系统作用的机制 ,从而严重地限制了淋病疫苗的研 CAGAATTTGACGCGCACGCCG3′。按文献方法进行 PCR 扩 究[1 ] 。通过对淋球菌 Por 、Pil 、Opa 和 LOS 等外膜抗原的研 增[2 ] ,反应结束后 ,取 PCR 产物作琼脂糖凝胶电泳 ,观察电 究 ,人们发现大多数淋球菌外膜抗原都具有非常大的抗原变 泳条带的大小。 异性。但是 ,为了研制有效的淋球菌疫苗 ,人们一直没有放 14 　真核重组质粒的构建和酶切鉴定 弃寻找具有免疫保护性的淋球菌保守抗原。Plante 等首先克 按pCMVscript 克隆试剂盒操作说明书要求 ,取 EcoR Ⅰ、 隆了淋球菌的奈瑟氏表面蛋白A 基因 ,发现 NspA 抗原不但 Kpn Ⅰ酶切后纯化的PCR 产物和 pCMVscript 质粒 DNA ,将两 在细菌表面持续表达 ,而且高度保守 ,并具有较强免疫原性 , 者按一定摩尔比混合、连接、转化和筛选阳性克隆。取阳性 是一个很好的淋球菌疫苗候选者 。为了研制具有较强免疫 克隆的质粒 ,对其进行酶切鉴定分析。将获得的重组质粒命 保护能力的淋病疫苗 ,我们在克隆淋球菌 NspA 全长基因的 名为pcNspA 。 基础上 ,构建淋球菌 NspA 真核细胞表达载体 ,为进一步研究 15 　序列测定和 BLAST 分析 淋球菌 NspA 基因疫苗在淋病预防中的作用奠定基础 。 提取含有正向插入 NspA 全长基因的质粒 pcNspA ,采用