穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO及ET-1的影响.docVIP

穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO及ET-1的影响 　　志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）是猪水肿病（ED）的主要致病因子[1,2]。目前的研究显示：SLT-Ⅱe致病机制是通过对其靶细胞-——肠黏膜微血管内皮细胞的刺激，引发细胞分泌机能的改变，释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能[3]。NO与ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的因子，分别有舒张和收缩血管的作用[4,5]。血管内皮细胞通过调控NO与ET-1的释放平衡来调节血管的功能[6]。 　　穿心莲内酯为爵床科植物穿心莲的有效成分。现代药理学研究表明，穿心莲内酯具有调节血管舒缩[7]、抗血栓及血小板聚集[8]等多种作用，对机体内微循环的调节具有重要意义。本试验旨从大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMMVECs）分泌NO与ET-1的角度，探讨SLT-Ⅱe具体的致病机制以及穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe损伤RIMMVECs的作用机制。 　　1材料与方法 　　1.1材料中职教学资源网 　　DMEM（Gibico）；标准胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe粗提物（扬州大学微生物实验室提供）；穿心莲内酯标准品（中国药品生物制品检定所）；大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（北京农学院实验室提供）；NO试剂盒（深圳晶美公司）；ET-1试剂盒（上海尚柏生物公司）。 　　1.2方法中职教学资源网 　　1.2.1大鼠肠黏膜微血管内皮细胞传代培养 　　选取第10代的细胞进行消化, 所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5 ×104 个?mL-1, 充分混匀后接种至96孔的培养板中,每个孔接种0.2 mL，然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。 　　1.2.2试验前细胞计数 　　培养48h 后，定时消化三孔细胞作计数，当细胞数量增至1×105 个?mL-1 时，用于实验。 　　1.2.3分组方案 　　各孔细胞分为空白对照组、SLT-Ⅱe组、SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组和SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组。空白对照组加DMEM维持培养基，其余三组加含有10 μg?mL-1 SLT-Ⅱe的DMEM维持培养基，2 h后再向SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组和SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组分别加入终浓度为5 μg?mL-1、20 μg?mL-1的穿心莲内酯液，置于CO2 培养箱中静置培养。 　　1.2.4取样中职教学资源网 　　每组分6 h、12 h、18 h三个观测点，在各时间点取样测定细胞上清液中NO和ET-1的含量。 　　1.2.5测定 　　NO的测定用硝酸还原酶法,按照试剂盒说明操作,使用分光光度计于530 nm 处检测。 　　ET-1的测定用ELISA法，按照试剂盒说明操作，使用酶标仪于450 nm 处检测。 　　1.2.6数据统计 　　采用SPSS11.0统计软件处理。 　　试验结果采用平均值±标准误表示，试验组间差异采用t检验法。 　　2结果 　　2.1不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌NO的影响 　　表1　不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌NO的影响（治疗组）（±S μmol?L-1）(n＝3) 组别 6 h 12 h 18 h 空白对照组 12.82±1.75 14.73±2.84 16.45±2.31 SLT-Ⅱe组 16.45±0.88 19.50±3.19 32.68±2.29** SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组 15.49±2.30 21.22±2.06** 31.34±2.82** SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组 17.02±3.26 15.69±2.32 16.25±4.8△ 　　注：与空白组对照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe组与SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组，SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯 　　2组对照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。 　　2.2不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌ET-1的影响 　　表2 不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌ET-1的影响（治疗组）（±S pg?mL-1）(n＝3) 　　 组别 ?6 h 12 h 18 h 空白对照组 1.33±0.55 2.32±0.45 2.91±0.61 SLT-Ⅱe组 10.27±1.21** 9.56±1.41** 8.35±0.89** SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组 10.31±0.81** 9.93±1.33** 7.71±0.59** SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组 12.47±1.19**△△ 13.08±0.53**△△ 13.67±0.61**△△ 　　注：与空白组对照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe组与SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组、SLT-Ⅱe＋穿心莲内