GB/T 19915.4-2005猪链球菌2型三重PCR检测方法.pdf

Culb53u/.uiu.3u 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 19915.4-2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法 MethodofdetectingStreptococcussuistype2bytriple-PCR 2005-09-27发布 2005-11-01实施 率督留瞥臀裂噜臀蓬臀臀暴发布 GB/T19915.4-2005 -L- ．曰 ‘， 月U 青 猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通 过伤 口感染该菌，并导致死亡。为了区别正常猪所携带的猪链球菌2型无毒菌株与发病猪分离的致病 菌株，特制定本标准。本标准是采用现代分子生物学诊断技术制定的。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：陆承平、姚火春、范红结、何孔旺。 GB/T19915.4-2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪链球菌2型荚膜基因c（ps2)、溶菌酶释放蛋白基因m（rp)和orf2这三个毒力基因 的三重PCR检测技术。 本标准适用于由猪链球菌2型致病基因和致病菌株的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有 的修改单 不（包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注 日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。 GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 猪链球菌2型 Streptococcussuestype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1^x34及1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌。 4 测定方法 4.1 方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落，加人PCR反应管中，进行 PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物， 与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。 4.2 试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水。 4.2.1cps2,mrp和orf2的上下游引物，按合成说明书使用。 4.2.2 TaqDNA聚合酶。 4.2.3 琼脂糖：电泳级。 4.2.4 溟化乙锭。 4.2.5 分子量标记：DL-2000. 4.2.6 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCI(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH8.0)0 4.2.7 10XPCR缓冲液：100mmol/LKC1,160mmol/L(NH,)2S020mmol/LMgSOa,200mmol/L Tris-HCI(pH8.8)，1％TritonX-100，1mg/mLBSA. 4.2.8 电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100ml-0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至 1000mL，使用时10倍稀释。 4.2.9 加样缓冲液：0.25％澳酚蓝，40％蔗糖。 4.2.10 阳性对照猪链球菌2型 HA9801株基因组 DNA模板，阴性对照马链球菌兽疫亚种 ATCC 35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板。 GB/T19915.4-2005 4.2.11 猪链球菌2型三重PCR反应混合物。 4.3 仪器和设备 4.3.1 离心机。 4.3.2 DNA热循环仪。