氟致牛外周血淋巴细胞凋亡及DNA 损伤效应.pdfVIP

氟致牛外周血淋巴细胞凋亡及 氟致牛外周血淋巴细胞凋亡及 DNA损伤效应 DNA损伤效应 报告人:王敏 报告人:王敏 • 目的与意义 • 材料与方法 • 结果 • 讨论 • 结论 目的与意义 目的与意义 • 氟是生命必需的微量元素之一，适量氟为机体正常生长发 育所必需，但过量会导致机体发生氟中毒。近年来对氟的 毒性作用开展了较深入的研究，氟中毒不仅能引起氟斑牙 和氟骨症，而且还会引起肾脏、肝脏、甲状旁腺和脑损 伤，甚至还产生遗传毒性。 • 目前，氟的免疫毒性是研究免疫器官的热点之一，从已有 资料来看，氟或氟化物能够导致机体细胞免疫和体液免疫 出现异常。为了深入研究氟中毒致机体免疫系统的毒性作 用及其机制，本研究采用NaF处理原代培养的淋巴细胞， 通过测定细胞存活率、检测DNALadder及DNA损伤等来 评价氟化物对淋巴细胞的损伤作用，为进一步了解氟致免 疫系统损伤的发生机理提供线索。 材料与方法 材料与方法 • 主要试剂 • 胎牛血清（FBS）、淋巴细胞分离液购自中国医 学科学院生物工程研究所；DMSO购自TBD公 司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；吖啶橙 (AO)、溴化乙锭(EB)购自Sigma公司；MTT购自 CAMBREX公司；NaF等其它试剂均为国产分析 纯。 • 1 、牛外周血淋巴细胞的分离培养及处理 • 无菌抽取健康成年黄牛静脉血，EDTA抗凝，应 用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用台盼蓝染色 观察细胞的存活率，调整细胞密度为2 ×105个/ml 接种于含10%FBS的RPMI1640培养液中， 37℃、5 ％CO2培养2h，在培养体系中分别加入 终浓度为0 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、 12 μg/ml、16 μg/ml的NaF溶液，继续培养24h后 进行检测。 • 2 、淋巴细胞活性的检测 4 • 采用MTT法，将淋巴细胞为每孔2 ×10 个细胞接 种于96孔培养板中，每孔体积200 μl，设空白对照 组，每孔加入MTT溶液（5mg/ml ）20 μl，继续孵 育4h ，终止培养，小心吸弃孔内的培养上清液， 每孔加入150 μlDMSO，震荡10min，使结晶部分 充分溶解，用酶标仪(波长490nm)测定OD值。试 验结果以细胞存活率表示。 • 3 、淋巴细胞凋亡的检测 • 3.1 AO/EB双荧光染色 • 收集1中培养的细胞，用PBS适当稀释，取50 μl细胞悬液 加入6 μl AO/EB染色液（AO/EB100 μg/ml ），混匀后， 将细胞悬液滴加到载玻片上，加盖玻片后于荧光显微镜下 观察计数。每个样品计数100个细胞，根据下面的公式计 算细胞凋亡指数。 • 3.2 DNALadder分析 • 收集1中培养的细胞，常规方法抽取DNA，1.5%琼脂糖凝 胶电泳，EB染色后凝胶成像系统观察。 • 4 、淋巴细胞DNA损伤的检测（碱性 SCGE ） • 制片：取100 μl 0.8%NMA加在磨沙载玻片上，盖上盖玻 片，4 ℃固化5min，即第1层胶。取细胞悬液10 μl与90 μl LMA混匀后加到第1层胶上，盖上盖玻片，4 ℃固化 10min，即第2层胶。将100 μl NMA铺在第2层胶上，加盖 玻片4 ℃固化10min，即第3层胶。 • 裂解：取下盖玻片，立即将凝胶载玻片浸没于预冷 的新配制的裂解液中2h 。 • 解旋：从裂解液中取出载玻片，用预冷的PBS漂 洗，移入电泳液中解旋20min 。 • 电泳：电压25V，电流300mA，低温避光