高考生物微生物的生长与控制.ppt

4．筛选自动化和筛选工具微型化 近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展，筛选实验实现了自动化和半自动化，省去了繁琐的劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。但筛选工具微型化的实验结果的准确性还有待提高。 * 三、微生物的杂交育种 微生物的杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经细胞结合、核融合、减数分裂，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢等。因此，常采用杂交育种的方法继续优化菌株。另外，由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难像诱变育种那样得到普遍的推广和应用。 * 四、原生质体融合育种? 原生质体融合育种的步骤主要包括标记菌株的筛选和稳定性验证、原生质体制备、等量原生质体加聚乙二醇促进融合、涂布于再生培养基、再长出菌落、选择性培养基上划线生长、分离验证、挑取融合子进一步试验保藏、生产性能筛选（如图6-28）。 图6-28 原生质体融合技术 * （一）标记菌株的筛选和稳定性验证 获得标记菌株的方法是采用常规诱变育种方法，筛选出营养缺陷型或抗药性标记菌株作为亲株，同时要求标记必须稳定。 （二）原生质体制备 微生物原生质的制备多用酶解法来进行，需选择合适的酶系进行细胞脱壁。可根据微生物细胞壁的不同结构和组成用不同的酶来处理。例如，细菌多用溶菌酶，真菌用纤维素酶，酵母菌多用蜗牛酶等，再结合一些其他措施以提高酶对细胞壁作用的敏感性，如采用复合酶液作用菌体或在处理液中添加EDTA和巯基乙醇等。 * 制备原生质体需注意的问题有： 1．菌龄 一般宜采用对数生长期的菌体。 2．酶的浓度 不同种类的微生物所用酶的浓度有所不同。在一定范围内当酶液浓度增加时，原生质体化也加快，如超过一定范围，反应速率不再明显提高。 3．酶解温度 酶解温度在25℃～40℃之间，一般采用35℃左右，酵母菌多数采用30℃左右为宜，青霉以33℃为佳，而曲霉则以25℃效果较好。 4．渗透压稳定剂 细胞壁溶解后，不论原来的细胞是杆状、球状还是丝状，形成的原生质体都呈球状。由于原生质体对渗透压敏感，所以必须使它处于高渗环境中以维持它的稳定性，否则就会在低渗条件下破裂失活。 * （三）原生质体融合 把二亲株原生质体混合在一起，用PEG（聚乙二醇）助融，然后将融合子涂布在再生平板上，保温培养后检出重组子。PEG的助融作用是原生质体能够高频融合重组的重要条件。 （四）融合子的检出 融合子的检出是指从融合后的反应系统中检出那些经过遗传交换并发生重组的融合子的过程。一般根据亲株的遗传标记，在选择培养基上直接筛选，为了提高再生率，也可在高渗培养基上再生，然后在选择性培养基检出重组子；若用电融合或荧光标记融合，也可在显微镜下用纤维操作仪挑取。 * 图6-29 基因工程育种示意图 基因工程育种的主要操作步骤如下： （一）提取目的基因和载体 （二）目的基因与载体体外重组 （三）载体传递 （四）复制、表达 （五）筛选、繁殖 五、基因工程育种 * 第五节 微生物的菌种保藏及复壮 一、微生物的菌种保藏 （一）斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，菌体长满斜面后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 4～6℃的冰箱中保藏。 培养时间过短，保存时容易死亡；培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于生长最适温度培养至菌种成熟进行保藏效果较好。 优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。 缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会较多。 * （二）液体石蜡保藏法 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4～4℃。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。 此法实用而且效果好，制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。 缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。 （三）干燥—载体保藏法 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。主要操作是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以砂土保藏用得较多。 * （四）冷冻保藏