单克隆抗体制备及应用-湖北师范学院生命科学学院.docVIP

单克隆抗体的制备及应用 李成鹏 （生命科学学院 0707班 学号: 2007114020717） 摘要 ：单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化是杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而厂生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B 淋巴细胞克隆产生的，故称单克隆抗体。 Key Word ：单克隆抗体 抗原 细胞融合 阳性克隆 1 单克隆抗体的特点 单克隆抗体技术是将骨髓瘤细胞和经某种抗原诱导产生的特异性 B 细胞 经 PEG 等融合剂作用 或电 激光 融合 ，形成杂交瘤细胞 然后筛选分离出单个阳性杂交瘤细胞。 再将其扩增 最终分离，纯化抗体的过程 。杂交瘤细胞具有双重特性 既能如骨髓瘤细胞般持续繁殖， 又能如 B 细胞一样分泌针对单一抗原表位的特异性抗体。 单克隆抗体与抗血清 又称多克隆抗体（ polyclonal antibody PcAb），主要区别是单克隆抗体是一种均一的免疫球蛋白分子， 具有针对一个抗原决定簇的特异性 ；与多克隆抗体相比， 单克隆抗体具有无可比拟的优越性: 如高特异性、高纯度、均质性好、 重复性好、效价高、等优点,在医学治疗及诊断等有广泛应用。 2 生产的基本流程： 3 　方法： 3.1 　免疫方案 用 150 mmol/L NaCl 将 COX22 蛋白配置成 1mg/ mL ,选取 6 只 4～6 周龄雌性Balb/c 小鼠 ,以每只小鼠 100μg蛋白的量 1 ∶1(体积比)将蛋白溶液和福氏完全佐剂混合乳化 ,进行第 1 次免疫;第 1次免疫后 3 周 ,进行第 2 次免疫 ,采用福氏不完全佐剂与蛋白液混合乳化(下同) ,2 周后进行第 3 次免疫;第 3 次免疫后第 7 天断尾取血 ,采用 Dot2 ELISA 的方法确定抗血清效价 ,达 1 ×10 以上的小鼠可用于融合(未能达到要求 ,于 2 周后进行第 4次免疫) ;2 周后经尾静脉不加佐剂加强免疫 1 次;3 d 后取脾融合. 3.2 　杂交瘤细胞株建立 以正常 Balb/c 小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞(2 ×410 /孔)为饲养细胞 ,取对数生长期的骨髓瘤细胞株7 8SP2/ 0 1 ×10 个细胞与免疫脾细胞1 ×10 个细胞 ,用50 %PEG作用 5 min 进行融合 ,经 HAT 和 HT 培养基选择性培养 ,3 周后当细胞生长超过孔底面积 1/ 3时 ,用间接法检测培养上清液 ,选择强阳性克隆 ,用有限稀释法连续克隆化 3 次 ,将克隆化后阳性率达100 %的细胞扩增培养后用于制备单抗腹水或液氮冻存。 3.4 效价的测定第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应 淋巴B细胞的特异性是不同的，经 培养液第一次筛选HAT出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞 二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞。的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法即ELISA），上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔, 阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3～4 次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞 第二次。筛选也是鉴定的过程。2 3.5 　McAb 效价的测定 McAb 效价测定用间接非竞争 ELISA 方法 ,以2μg/ mL 目的抗原为包被抗原,以 SP2/ 0 细胞培养上清为阴性对照 , 从 1 ∶1 000(体积比)开始系列稀释待检McAb ,以(Aexp2Ablank )/ (Aref2Ablank ) ≥2. 1 的最大稀释倍数为抗体效价. 3.6　腹水抗体纯化与浓度分析 首先采用二氧化硅吸附法 ,除去腹水中的细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等 ,然后用硫酸铵沉淀法和 DEAE 离子交换层析柱法依次纯化。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2) 鉴定单抗的纯度.采用考马斯亮蓝比色法测定其含量。 3.7　抗体特异性的鉴定 纯化单克隆抗体分别与 Ovine、Canine 、Rabbit、Rat 和 Murin 的 目的 抗原 ,以及Mouse、Rat、Guinea pig、Sheep 和 Murine 的目的抗原进行交叉反应试验 ,方法采用 ELISA。 鼠源性单克隆抗体的改造 由于人-人杂交瘤技术的障碍，杂交瘤单克隆抗体均为鼠源性，大量应用于人体时，可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果等均受到严重的影响，甚至引起严重的毒副作用。所以，单克隆抗体的研究在20世纪80年代末步入低谷。然而，此时蓬勃发展起来的分子生物学技术。开始对鼠源性单克隆抗体进行基因