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从苋菜中提取氢过氧化物裂解酶工艺 熊杰,刘庆庆,孔祥珍,张彩猛,华欲飞 江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏 无锡, 摘 要 在高等植物中,氢过氧化物裂解酶, 可将脂肪氧合酶氧化多不饱和脂肪酸产 生的氢过氧化物催化裂解,生成的己醛、已烯醛等芳香性物质具有果蔬的新鲜气味,是食品行业和目化工业中的 重要芳香风味添加剂。实验以苋菜为研究对象,在单因素 、半胱氨酸浓度、匀浆转速、聚乙烯吡咯烷酮浓度 实验基础上,运用 因素 水平的正交实验,对的提取工艺进行了优化,即在/ ,以 . 的含有 / 半胱氨酸和 . %质量浓度的为缓冲液提取 ,得到的具有很高的酶活。 并探索了抽真空对提取的影响,在抽真空完全除去氧的情况下提取,酶活得到显著提高。 关键词 氢过氧化物裂解酶 ,苋菜,总酶活,真空 氢过氧化物裂解酶 是植物脂质氧化途径型离心机,日本 立;型分光光 中重要的酶。它是植物产生清香风味成分基本途径 度计, 本岛津;组织捣碎机,美国公司; / 中的关键性酶之一,在天然风味的合成 型计,梅特勒.托利多公司。 中有重要作用。 . 实验方法 年, 等在香蕉中首次发现一种可以 . . 亚油酸氢过氧化物和亚麻酸氢过氧化物的制 备 将脂肪酸氢过氧化物裂解的酶,并将其命名为醛酶。 随后,等在西瓜幼苗中也发现了它的存在,并进 亚麻酸或亚油酸溶于无水乙醇中, 行了分离纯化,后将其命名为氢过氧化物裂解酶 。 后转移至预先通氧气至饱和的. / 氢过氧化物裂解酶广泛分布于绿叶植物中,苋菜中 . 的硼酸盐缓冲液中,随后加入溶入少量 的硼酸盐缓冲液的。快速搅拌均匀后在冰浴和一含量最高 。是生产天然挥发性风味物 持续通氧条件下反应 . ,随后用/ 调 质 醛类的关键酶类,然而也是此技术工业化的瓶 节反应液至. 以下结束反应。用等体积无水乙 颈。如何通过生物化学方法提高酶的活力、提取率、 醚萃取反应液 次后合并有机相,加入无水 稳定性以及如何在反应过程中通过合适的添加剂稳 干燥,过滤后在 ℃下旋转蒸发除去乙醚,残留部分 定酶在反应过程中的性能,以获得 醛类合成量和 为亚麻酸氢过氧化物. 或亚油酸氢过氧 转化率的大规模提高是进一步推进此技术商业应用 的突破口。本文主要以苋菜为研究对象,探究了化物 ,将其溶于一定量乙醇,充氮后分 装于一 ℃下密封保存 。 值、半胱氨酸、匀浆转速、聚乙烯吡咯烷酮 浓度 . . 氢过氧化物裂解酶粗酶的提取 以及抽真空除去氧气对氢过氧化物裂解酶总酶活的 取 去掉根、茎,并切成小片的苋菜,与影响,得到一条提取氢过氧化物裂解酶的新工艺。 合适的 含有一定浓度聚乙烯吡咯烷酮 一 实验材料与方法 和 . / 的 ?缓冲液共同均浆 分 次, 每次 ,间隔。均浆液经 层纱布过滤,滤液在 . 实验材料 ℃下 / 离心 。弃上清液取沉淀悬 苋菜,购于华润万家超市。二硫苏糖醇 、 浮于 含 / 和 . % / 大豆脂肪氧合酶 、亚油酸、亚麻酸、己 一的 . 的 . / 的磷酸盐缓冲液中, 醛、己烯醛均购于公司。其他试剂为分析纯。 称取质量为 ,在层析柜 中搅拌 ,在 ℃ 第一作者:在读硕士 华欲飞教授为通讯作者 。 下保存,供测酶活使用 由于不同批次购买的苋菜有 国家 计划基金 ;中央高校基本科研业务费 专项资金资助。 差异,确保实验的准确性,所以每组单因素实验都是 收稿日期: ? 一 ,改回日期:一 ? 在同一批次的苋菜中进行 。 生蔓 鲞蔓 塑璺蔓 塑塑. . 氢过氧化物裂解酶酶活的测定 根据基因比对,应属于细胞色素 ? 取 ,质量为 的酶溶解液,加入到含 ,家族的一个新成员 ,根 / 和 . % / 一 的 据同源性又可分为 和 两种。和其 . 的 . / 的磷酸盐缓冲液中,并在层析柜 他酶一样,在 末端有 个保守区域, 中搅拌。然后取 稀释好的酶液和 其中保守区 含有和血红素相连的半胱氨酸 。 杠 的一 底物与 . 的 等对重组青椒中高度保守的半胱 . / 磷酸盐, 缓冲液混 氨酸的 进行点突变后发现重组蛋白不含血红 合,在波长 下测定其吸光值在内的线 素铁,溶解性和酶活性都降低,说明半胱氨酸和蛋白 性下降值 。空白为 酶液和 . 的 活性中心的血红素高度相关。因此在提取过程 . / 磷酸盐缓冲液混合。酶活力单位定义 中,加入一定浓度的半胱氨酸,对本身起保护作 为:每分钟每裂解 的 一 所需的酶量 用,我们对半胱氨酸的最适浓度进行了探究,其中一一 。 为 . ,匀浆转速为 / ,的浓度为 . %,结果如图 所示。 单位酶活力/苎 墨争 总酶活力是 . 数据分析 所有数据至少重复 次,取平均值。 结果与讨论 蝗溢珀 .... 半胱氨酸浓度/.对提取的影响 ㈣㈣