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报告编号： 合同编号：20091113009 科 技 查 新 报 告 项目名称： 系列食源性病原菌 ICT 快速检测试剂盒 的研制与开发 委 托 人： 广东检验检疫技术中心 委托日期 ：2009 年 11 月 13 日 查新机构（盖章）：广东省科学技术情报研究所 查新完成日期：年月日 中华人民共和国科学技术部 二ООО年制 中文： 系列食源性病原菌 ICT 快速检测试剂盒的研制与开发 查新项目名称 英文（国内外）： 机构名称 广东省科学技术情报研究所 查 通信地址 广州市连新路 171 号科学馆大院内科技信息大楼九楼查新检索中心 新 邮政编码 510033 电子邮箱 ywb303@163.com 机 负 责 人 罗秀豪 电 话 020 传 真 020 构 联 系 人 余文斌 电 话 1 020808 电 话2 020808 一、查新目的 成果鉴定查新 二、查新项目的科学技术要点 本研究用大肠杆菌O157和单增李斯特氏菌全菌体抗原多次免疫新西兰大白兔,制备抗大肠杆菌 O157 和抗单增李斯特氏菌多克隆抗体。用辛酸-硫酸胺法和Protein G亲和层析 2 种方法分别纯化 制备的多克隆抗体,结果表明两种方法纯化后抗体的纯度均达到 85%以上，但效价测定显示Protein G法纯化后抗体的效价有一定程度下降，而辛酸-硫酸胺法纯化的抗体效价较好。因此，对两种菌体 多抗均采用辛酸-硫酸胺法进行纯化。根据试纸条的侧向流动和胶体金的示踪功能,结合免疫学原 理,分别建立并优化了检测大肠杆菌O157 和李斯特氏菌的双抗体夹心免疫胶体金方法。测定了胶体 金颗粒的最优化反应体系:胶体金颗粒的大小为 30nm；抗大肠杆菌O157 抗体与胶体金溶液结合的最 适标记pH值为 7.2，抗李斯特菌抗体的最适标记pH值为 8.0；标记抗大肠杆菌O157 抗体的最低用量 为 35μg/ml，实际工作中的最适标记量为 40μg/ml。标记李斯特菌抗体的最低用量为 40μg/ml， 实际工作中的最适标记量为45μg/ml；大肠杆菌O157检测条检测线抗体最佳包被浓度为2.5 mg/ml， 金标抗的最佳稀释比例为 1:8。李斯特菌检测条检测线抗体最佳包被浓度为 2 mg/ml，金标抗的最 佳稀释比例为 1:6；质控线羊抗兔IgG最佳包被浓度为 2.5 mg/ml；确定检测线的包被位置为距NC 膜下缘 0.7cm处，检测线与质控线间的距离为 0.4cm。用研制的大肠杆菌O157和单增李斯特氏菌ICT 试剂盒对实验室保存的已鉴定 8 株O157、20 株单增李斯特氏菌菌株进行检测,大肠杆菌O157 符合率 为 87.5%,单增李斯特氏菌符合率为 90%，两种试剂条检测下限均为 105CFU/mL,显色时间为 3～5 分 钟。两种试剂条的特异性、重复性和敏感性较好,可应用于实际检测工作中。 三、查新点与查新要求 A、查新点： 1.大肠杆菌 O157 和单增李斯特氏菌菌体抗原免疫新西兰大白兔，成功制备了高效价的抗大肠 杆菌 O157 的多克隆抗体和抗单增李斯特氏菌多克隆抗体。 2.比较了硫酸胺法、辛酸-硫酸胺法、Protein G亲和层析法。结果抗大肠杆菌 O157和抗单增 李斯特氏菌抗体的最优纯化方法为辛酸-硫酸胺法。 3.建立了大肠杆菌 O157 和单增李斯特氏菌的胶体金免疫层析法，对免疫胶体金层析法进行了 系统的研究，优化了制备试纸条的条件，获得了优化体系的各项反应参数。 4.用已建立的大肠杆菌O157和单增李斯特氏菌免疫层析法对实验室保存的 50多株已鉴定的菌 株进行检测，与传统检测方法比较，其阳性检出率的符合率大肠杆菌 O157 为 87.5%、单增李斯特 氏菌为 90%。大肠杆菌 O157 和单增李斯特氏菌的免疫胶体金试纸条快速、特异、敏感，具有商品 化的开发基础。