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实验六 PCR产物的胶回收分离纯化 一、实验目的 二、实验原理 【仪器与试剂】 一、实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪 3、离心机 4、单面刀片 5、恒温水浴锅 二、试剂 1、 DNA回收试剂盒 2、50×TAE 3、ddH2O 三、实验步骤 注意事项： 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛； 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。 * * 满朝来 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 生化与分子生物学教研室 1、了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理。 2、掌握PCR产物纯化的实验技术，为后续的连接 反应和转化反应打下良好的基础。 首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。 1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。 2） 按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。 3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。 4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6） 12000rpm 室温空离心1分钟。 7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 8）琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。 实验操作流程图 切胶示意图 凝胶纯化结果示意图 *
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