大鼠delta阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体与鉴定.docVIP

 大鼠 delta 阿片受体基因小发卡 RNA 及人前 脑啡肽原基因双表达慢病毒载体与鉴定# 逄坤芳，陈鹤翔，卜慧莲，杨辉** 5 10 15 20 25 30 35 40 45 （华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，武汉 430030） 摘要：阿片类药物长期应用于慢性、顽固性疼痛病人可导致药物耐受，影响治疗效果并增加 副作用，其发生机制可能与μ受体(DOR)和δ受体(DOR)形成异源二聚体后经细胞内吞，泛素 化并在溶酶体中降解有关。人前脑啡肽原基因（(hPPE) 编码前脑啡肽，在翻译过程经不同 蛋白酶降解形成甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽，通过μ\δ受体结合参与内源性疼痛制， 发挥重要的镇痛作用。目的 构建大鼠 delta 阿片受体(DOR)基因小发卡 RNA(shRNA)及人前 脑啡肽原基因(hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法 根据大鼠 DOR mRNA 序列设计 shRNA 并合成包含正、反义靶序列的互补 D N A 链，退火后插入至 shRNA 表达载体 pENTR/U6 vector 中，构建 shRNA 表达质粒，并转化至感受态细胞 DH5?，抽提质粒后进行测序。合成 hPPE 基 因序列并插入到表达载体 pcDNA3.1(+)中，转化至感受态细胞 DH5?，挑取多个单克隆进行 测 序 验证 。将 hPPE 插入 已构 建 成功 的 pENTR/U6 shRNA 载 体中 ，再 与慢 病毒 载 体 pLenti7.3/V5-DEST 重组，构建慢病毒载体 pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA 并转化 DH5α感受态 细胞，筛选阳性克隆并测序验证，保留测序验证正确的 LR 重组质粒。用构建的慢病毒表达 载体 pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA 和包装质粒共转染 293T 细胞，包装病毒，收集病毒原液， 超速离心浓缩，并测定滴度。结果 经测序验证重组质粒 pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE 和慢病毒载体 pLenti-CMV-HPPE-U6-shRNA 均构建成功。大鼠 delta 阿片受体基因小发卡 RNA 及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功，病毒滴度为 1×107 TU/ml。结论 大鼠 delta 阿片受体基因小发卡 RNA 及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功，为研究 DOR 和 hPPE 在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。 关键词：阿片受体；人前脑啡肽原基因；RNA 干扰；慢病毒；吗啡耐受 中图分类号：R614 Construction and identification of lentivector encoding rat delta opioid receptor shRNA and human preproenkephalin gene PANG Kunfang, CHEN Hexiang, BU Huilian, YANG Hui (Department of Anesthesiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, WuHan 430030) Abstract: Objective To construct lentivector encoding rat delta opioid receptor shRNA and human preproenkephalin gene and identify its titer. Methods According to the sequence of rat DOR mRNA, we designed its shRNA sequence and synthetized the sense and antisense oligonucleotides. After annealing, these double DNA strands were cloned to the pENTR/U6 vector and then transformed into competent cell DH5a. The plasmids were extracted and sequenced. HPPE gene sequence was synthetized and inserted into the expression vector pcDNA3.1 (+), then the recombinant plasmid was transformed into competent cell DH5a,