质粒的小量提取.pptVIP

质粒DNA的小量提取 王少华 从大肠杆菌细胞中分离出质粒DNA 通常采用碱裂解法 碱裂解法基本原理 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 试剂 溶液I 25 mM Tris-Cl：保持溶液适当的 pH 10 mM EDTA（pH 8.0 ）：Ca 2+和Mg 2+等二价金属离子的螯合剂抑制DNase的活性，和抑制微生物生长 50 mM葡萄糖： 使大肠杆菌在溶液中保持悬浮 注意：菌体一定要悬浮均匀 溶液II： 0.2 mM NaOH +1% SDS（现用现配） NaOH是最佳的溶解细胞的试剂 由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致 ，加SDS是为下一步作铺垫. 这一步注意事项： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂 溶液III 5M 醋酸钾 60mL 冰醋酸 11.5mL 水 28.5mL 溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的复合物 钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了 冰醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA. 沉淀的形成不能将所有的蛋白质沉淀了，因此要用酚/氯仿进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，否则时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。 实验方法 1．挑取培养板上的划线菌接菌至5mL LB培养液中（含Amp 50μg/mL），37℃, 200rpm过夜摇菌。 2．取1.5mL培养液至Eppendorf管中，12,000rpm离心30秒，弃上清，重复集菌2-3次，收集菌液的总体积为3-5mL； 3．将细菌沉淀悬浮于100μL预冷溶液Ⅰ中，充分重悬菌体； 4．加入200μL溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，室温放置2-5min； 5．加入150μL预冷的溶液Ⅲ，轻柔颠倒数次，冰上放置5min； 6．12,000rpm 4 ℃离心5min，取上清移到１个新的Eppendorf管中；加入无DNA酶的RNA酶至终浓度10μg/mL，37℃水浴中消化30-60min； 7．加入等体积酚/氯仿（1:1），振荡混匀10min， 4℃ 12,000rpm 离心10min，取上清移至另１个Eppendorf管中； 8. 加入等体积氯仿，振荡混匀10min， 4℃ 12,000rpm 离心10min，取上清移至另１个Eppendorf管中； 9．加入2倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2min， 4 ℃ 12,000rpm , 离心5min； 10．弃上清，加入１mL 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次， 4 ℃ 12,000rpm 离心2min； 11．弃上清，抽干乙醇，或室温干燥（5-15min）； 12．加入50μL TE溶解DNA。 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型 相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样 ，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的是开环。 紫外分光光度计测浓度 最常用的测定核酸浓度的方法 基本原理：嘌呤和嘧啶碱基中均具有共轭双键（-C C-C C-），能够吸收250-280nm波长的紫外光。 DNA、RNA最大紫外吸收值在260nm左右 质粒进行细胞转染前必须测定两个值： 质粒的浓度以及OD260/OD280 OD260/OD280必须达到1.7 必须琼脂糖凝胶检测以确定质粒的完整性 * * 在pH 12.0-12.6碱性环境中，蛋白质和染色体DNA发生变性，染色体氢键断裂双螺旋结构解开，而质粒DNA随大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离 电泳检测 开环 线性 超螺旋